Autof MS 1000質譜鑒定系統對臨床分離病原菌的鑒定能力評價*

陸 丹，周雪婷，陳雨婷，魏 望，曹宇杰，薛 魁

徐州醫科大學附屬邳州市人民醫院檢驗科，江蘇邳州 221300

感染性疾病是臨床常見疾病之一，嚴重危害人類健康。對于重癥感染患者，若病情未能得到及時控制，可導致多器官功能障礙、感染性休克甚至死亡，而早期應用敏感抗菌藥物治療是控制病情的關鍵舉措[1]。除了規范抗菌藥物使用之外，病原菌的快速、有效鑒定顯得尤為重要，對患者的生存率和病死率有著重要影響[2]。目前，微生物實驗室對臨床可疑感染標本的病原菌檢測多基于傳統的形態學、分離培養及生化反應，操作煩瑣且周期較長；基于分子的生物學技術不需要微生物的培養生長，比傳統方法更具優勢，但由于該技術對人員要求較高，且成本較高，難以在各種類型的實驗室開展，大規模應用可能受到限制[2]。近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術，以其快速、高通量、高效率、低成本的特點，徹底改變了臨床微生物實驗室的微生物鑒定方法，使臨床微生物學的鑒定發生了革命性變化[3]。Autof MS 1000質譜鑒定系統為當今市場諸多MALDI-TOF MS質譜分析系統之一，由鄭州安圖生物有限公司生產，因此，本研究旨在通過對本院臨床分離菌株進行鑒定，以評價Autof MS 1000 質譜鑒定系統在微生物實驗室的鑒定能力，為其能否在各實驗室開展提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2020年9月至2021年5月分離自臨床的常見非重復菌株共190株。其中革蘭陽性需氧菌58株，革蘭陰性需氧菌93株，厭氧菌6株，酵母樣真菌33株。

1.2儀器與試劑 Autof MS 1000質譜鑒定系統及配套試劑購自鄭州安圖生物有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統及配套鑒定卡購自法國生物梅里埃有限公司。

1.3質控菌株 質控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 ATCC 29213、腸球菌ATCC 29212、白色假絲酵母菌ATCC 14053均由鄭州安圖生物有限公司提供。

1.4方法

1.4.1VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定 對分離培養得到的純菌落進行涂片及革蘭染色，根據菌落形態和染色結果選擇相應的配套鑒定卡上機檢測，嚴格按照說明書規范操作。可信度>90% 的唯一鑒定結果為可接受結果。

1.4.2Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定 對分離培養得到的純菌落使用直涂法或甲酸涂布法上機檢測，嚴格按照說明書規范操作。質譜鑒定結果以分數表示，分數為0.0～10.0分。得分區間為9.5～10.0分表示該結果種水平可信；得分區間為9.0～<9.5分表示該結果屬水平可信，種水平參考；得分區間為6.0～<9.0分表示該結果屬水平參考，需結合其他鑒定方法驗證；得分區間為0.0～<6.0分表示該結果不可信。本研究Autof MS1000質譜鑒定系統鑒定結果可信水平>9.0分為可接受結果。

1.4.3鑒定結果分析 以實驗室已有的VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定結果為參比結果，Autof MS 1000質譜鑒定系統和VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定結果不一致的菌株、Autof MS 1000質譜鑒定系統或VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統未鑒定出或鑒定結果不可信的菌株首先應用上述兩種方法重復鑒定，結果仍不可接受的送至北京睿博興科生物技術有限公司進行細菌16SrDNA測序或真菌ITS區測序，以測序結果為“金標準”[4]。

1.5統計學處理 采用SPSS21.0 統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株分布及鑒定結果 本研究共納入190株菌株，分別分離自痰液、血液、尿液、腦脊液、胸腔積液、腹水、傷口分泌物、膿液等標本，覆蓋本院80%～90%常見病原菌。其中革蘭陽性需氧菌58株，包括葡萄球菌屬30株，鏈球菌屬15株，腸球菌屬7株，棒桿菌屬3株，諾卡菌屬2株，芽孢桿菌屬1株；革蘭陰性需氧菌93株，包括腸桿菌科細菌50株，非發酵菌及其他少見革蘭陰性需氧菌43株；厭氧菌6株；酵母樣真菌33株。在190株分離株中，Autof MS 1000質譜鑒定系統可將180株(94.7%)鑒定至種，分數均>9.0分；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統可將179株(94.2%)鑒定至種，可信度均>90%。Autof MS 1000質譜鑒定系統與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統相比，在種水平上一致的有166株(87.4%)，在屬水平上一致的有20株(10.5%)，完全不一致或未鑒定出結果的有4株(2.1%)。其中58株革蘭陽性需氧菌中，種水平鑒定一致的有51株(87.9%)，屬水平鑒定一致的有5株(8.6%)，2株VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統未鑒定出(3.4%)；93株革蘭陰性需氧菌中，種水平鑒定一致的有80株(86.0%)，屬水平鑒定一致的有12株(12.9%)，1株Autof MS 1000質譜鑒定系統與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統均未鑒定出(1.1%)；6株厭氧菌中，種水平鑒定一致的有4株(66.7%)，屬水平鑒定一致的有2株(33.3%)；33株酵母樣真菌中，種水平鑒定一致的有31株(93.9%)，屬水平鑒定一致的有1株(3.0%)，1株VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統未鑒定出(3.0%)。

2.2結果不一致分析 本次分析的190株菌株中，共有24株(12.6%)鑒定結果在種水平上不一致。其中20株(10.5%)在屬水平上一致，3株(1.6%)VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統未鑒定出，1株(0.5%)VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統及Autof MS 1000質譜鑒定系統均未鑒定出。見表1。以測序結果為“金標準”，Autof MS 1000質譜鑒定系統的準確率為70.8%(17/24)，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統的準確率為45.8%(11/24)，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩種系統鑒定結果不一致或無鑒定結果的比較分析

續表1 兩種系統鑒定結果不一致或無鑒定結果的比較分析

2.3鑒定總準確率分析 190株菌株中，Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定總準確率[93.2%(177/190)]略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定總準確率[90.0%(171/190)]，差異無統計學意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質譜鑒定系統革蘭陽性需氧菌鑒定準確率為94.8%(55/58)，略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準確率(89.2%，83/93)；厭氧菌鑒定準確率為100.0%(6/6)；酵母樣真菌鑒定準確率為100.0%(33/33)。見表2。

表2 兩個系統對臨床分離病原菌鑒定準確率的比較分析[%(n/n)]

3 討 論

目前臨床病原菌的鑒定主要依靠傳統的表型鑒定及分子生物學鑒定。傳統的表型鑒定包括細菌的分離培養、菌落形態及生理生化反應等，操作煩瑣，周期較長且靈敏度及特異度低。此外，有些細菌較難培養，容易造成病原菌的漏檢或誤檢，影響臨床治療。近年來，分子生物學的快速發展極大縮短了鑒定周期，其快速、特異度高、靈敏度高及準確率高等優勢為臨床感染性疾病的診治提供新的思路。分子生物學鑒定包括基于核酸水平的檢測，如實時熒光定量PCR、限制性片段長度多態性分析、基因芯片、DNA測序等，以及蛋白水平的檢測，如MALDI-TOF MS技術[5-6]。MALDI-TOF MS技術能通過鑒別微生物不同質量蛋白獲得蛋白指紋圖譜，通過與數據庫信息比對，篩選并確定相應圖譜，進而得到鑒定結果，從而實現對不同細菌種、屬的鑒定，快速、準確且成本低，被認為是基因測序的可替代方法[7]。

目前法國生物梅里埃等多家公司的質譜系統已常規用于實驗室病原菌的檢測。近年來，國產Autof MS 1000質譜鑒定系統在臨床工作中的優勢也逐漸顯現出來，本研究旨在通過對本院常見臨床病原菌的鑒定來評價該系統的鑒定能力。

本研究結果顯示，Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定總準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定總準確率，差異無統計學意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質譜鑒定系統對革蘭陽性需氧菌鑒定準確率略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準確率；24株種水平不一致或未鑒定出結果的菌株中，Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定準確率為70.8%，高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定的準確率(45.8%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

58株革蘭陽性需氧菌中，Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統。Autof MS 1000質譜鑒定系統對葡萄球菌屬、腸球菌屬的鑒定準確率為100.0%，對肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌及口腔鏈球菌的鑒定能力相對較差，但因標本量少，更多研究將在后續實驗中繼續驗證。之前相關研究表明，鏈球菌屬鑒定準確率低的原因可能是細菌之間親緣關系較近、同源性較高進而導致蛋白峰差異不明顯的緣故[8]。因此在臨床工作中，應結合其他輔助方法如奧普托欣敏感試驗做出正確判斷。2株諾卡菌屬VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統均未鑒定出結果，而Autof MS 1000質譜鑒定系統則100.0%鑒定，說明Autof MS 1000質譜鑒定系統對一些臨床罕見菌的準確鑒定優勢明顯。

93株革蘭陰性需氧菌中，Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定準確率略高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統。Autof MS 1000質譜鑒定系統對陰溝腸桿菌復合群及鮑曼不動桿菌不能正確鑒定至種，Autof MS 1000質譜鑒定系統將陰溝腸桿菌鑒定為陰溝/阿氏腸桿菌和霍氏腸桿菌，將鮑曼不動桿菌鑒定為醋酸鈣不動桿菌和醫院不動桿菌。分析原因可能為細菌親緣關系近，蛋白高度相似，Autof MS 1000質譜鑒定系統不能準確區分至種或亞種，必要時需輔以其他試驗確認，如通過實時熒光定量PCR擴增dnaJ基因可將陰溝腸桿菌復合群鑒定至種[9]。對于1株沙門菌，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統及Autof MS 1000質譜鑒定系統均只能鑒定至屬，需輔以血清凝集試驗進一步鑒定至種或亞種。以上均是導致革蘭陰性需氧菌的鑒定準確率低于革蘭陽性需氧菌的原因。對于其他腸桿菌科細菌、非發酵菌及臨床少見革蘭陰性桿菌，Autof MS 1000質譜鑒定系統均能正確鑒定。特別是本次鑒定的馬耳他布魯菌，作為一種潛在的生物恐怖病原菌，容易導致實驗室獲得性感染，對人具有極強的致病力，因此，早期鑒定對于生物安全防護、規避風險至關重要。Autof MS 1000質譜鑒定系統和VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統均未鑒定出鹵代二氫鹽單胞菌，經分析與數據庫不完整、Autof MS 1000質譜鑒定系統中不存在其標準圖譜有關，需要廠家及時擴展更新。但值得注意的是，數據庫中已知典型微生物的數量只占全球多樣性的一小部分，因此在嚴格意義上現有的數據庫永遠不可能是完整的。在臨床微生物學中，雖然對與人體相關微生物的認識已經達到了很高的水平，但由于存在地區差異性及來源多樣性等問題，仍然需要不斷研究和完善[10]。

厭氧菌因其生長緩慢、生長條件苛刻等因而在臨床鑒定中相對困難。本研究中Autof MS 1000質譜鑒定系統將6株厭氧菌均正確鑒定至種，其準確率明顯高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統，且顯著減少了標本周轉時間，優勢明顯。由于納入菌株數量少不足以評價，需在后期實驗中加大標本量繼續予以評估。但已有研究表明，在鑒定已知138株脆弱擬桿菌的分析評價中，Autof MS 1000質譜鑒定系統相比其他一些鑒定系統在種水平上有更高的準確率[11]。

近期，有研究表明，Autof MS 1000質譜鑒定系統對其鑒定能力異常突出，鑒定準確率明顯優于VITEK MS質譜鑒定系統，尤其對于一些罕見的酵母樣真菌[12]。本研究結果顯示，Autof MS 1000質譜鑒定系統對33株酵母樣真菌的鑒定準確率高于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統鑒定準確率，對于少見菌如平常假絲酵母菌、皮瘤毛孢子菌亦能正確鑒定，雖然納入菌株數量有限，仍需進一步研究，但Autof MS 1000質譜鑒定系統對酵母樣真菌的鑒定價值初步體現。

本研究顯示，Autof MS 1000質譜鑒定系統與VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統的鑒定結果較為一致，差異無統計學意義(P>0.05)，但Autof MS 1000質譜鑒定系統鑒定時間短、操作簡單、成本較低，特別對臨床罕見菌鑒定效果尤為突出，明顯優于VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統，這與文獻[13-14]報道結果一致。同時，Autof MS 1000質譜鑒定系統具有中國本土化的菌株蛋白指紋圖譜數據庫，更適合中國用戶，適合在國內實驗室推廣使用。

MALDI-TOF MS技術是近年來迅速興起的新型微生物鑒定技術，及時、準確地鑒定病原菌能夠減少周轉時間、快速提供細菌學診斷，早期合理地進行干預治療，有利于減少細菌耐藥、控制病情、改善預后[15-16]。對于一些致病性強的病原菌，MALDI-TOF MS技術能夠在不到1 h之內知曉結果，對于生物安全防范至關重要。盡管MALDI-TOF MS技術優勢明顯，但因為技術的局限性，仍存在不足之處。首先，質譜技術對檢測藥物敏感性試驗的方法尚未應用于常規檢測[17]，鑒定結果上報臨床后，需根據當地的細菌耐藥數據初步選擇抗菌藥物，最后藥敏結果仍依賴傳統的藥敏實驗。但鑒于其較高的種屬符合率，可作為初級報告上報臨床，滿足臨床早期診斷的需求[18]。其次，細菌的正確鑒定很大程度上取決于數據庫的完整性，需要不斷地擴展和更新。此外，質譜技術目前只能鑒定單一菌落，關于混合感染情況下的質譜鑒定有待進一步研究。最后，一些鑒定前因素也影響質譜鑒定結果，如培養基成分、多次傳代培養、培養溫度、黏液型菌落、涂布菌量的多少等[8]。因此，規范操作、排除客觀因素的影響對于病原菌的正確鑒定至關重要。

總之，MALDI-TOF MS技術是現代微生物學上的巨大變革，Autof MS 1000質譜鑒定系統作為國產質譜系統滿足臨床對微生物鑒定的需求，建議在實驗室推廣使用。但由于本研究室質譜技術開展時間相對較短，故而納入研究菌株數量有限，后期將加大標本量繼續驗證。考慮到每種方法都有其局限性，因此，多種檢測方法的聯合應用可為臨床快速、可靠的診斷提供依據。