宏基因組學第二代測序技術在慢性子宮內(nèi)膜炎患者中的應用分析*

黃高波,彭 芳,李 誠,龔燕飛

岳陽市中心醫(yī)院生殖中心，湖南岳陽 414500

慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)是發(fā)生在子宮內(nèi)膜上的慢性炎癥，一般情況下無明顯癥狀，或者伴有輕微的癥狀，病理檢測顯示主要以子宮內(nèi)膜間質(zhì)的漿細胞浸潤為特征[1]。研究表明，在婦科疾病中CE的患病率為10%～11%[2]。因CE臨床癥狀表現(xiàn)輕微，容易受到婦科醫(yī)生和病理學專家的忽視[3]。在輔助生殖的研究中發(fā)現(xiàn)，CE顯著影響患者的胚胎著床，以及后續(xù)的胚胎發(fā)育，造成反復著床失敗(RIF)或復發(fā)性流產(chǎn)(RPL)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在RIF或RPL患者中，CE的發(fā)病率要顯著高于健康人群[5]。CE診斷基于組織病理學鑒定漿細胞，子宮內(nèi)膜微生物檢測則能為治療提供客觀、可靠的指導信息[6]。因此，如何能快速、有效地診斷出CE患者的微生物感染類型，在臨床上有著重大意義。

微生物宏基因組學第二代測序(mNGS)，檢測覆蓋范圍大，病毒、細菌、真菌、寄生蟲都能被同時檢測[7]，并且有著較高的靈敏度。在臨床上使用越來越多，如對腦脊液、血液及呼吸道感染部位進行檢測，結果顯示mNGS可提高病原體的陽性率[8-9]。在CE患者中，用mNGS對病原體進行檢測的研究較少。本研究擬探討mNGS在CE患者子宮內(nèi)膜微生物檢測的有效性，并與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)進行對比，觀察其對微生物檢測的陽性率及后續(xù)對CE患者治愈率的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年12月在本院生殖中心診斷為CE的不孕不育患者共139例作為研究對象。研究對象在進行子宮內(nèi)膜取樣前均未使用任何抗菌藥物治療?；颊吣挲g22～44歲，平均年齡為(33.05±5.03)歲。研究對象符合CE診斷標準[10]。將139例研究對象隨機分為組1、組2，子宮內(nèi)膜取樣后進行微生物培養(yǎng)檢測的患者85例作為組1，子宮內(nèi)膜取樣后進行mNGS檢測的患者54例作為組2。

1.2子宮內(nèi)膜宮腔取樣

1.2.1通過負壓取樣器吸取宮腔標本 為防止陰道內(nèi)細菌對標本的影響，清洗外陰后，放置窺陰器，然后用碘伏溶液浸泡紗布擦洗宮頸口，生理鹽水棉拭子擦除宮頸外口黏液。之后用全封閉的負壓取樣器進行內(nèi)膜取樣,取出的標本密封無菌保存送至實驗室，用于病原體培養(yǎng)或病原體全基因組測序。

1.2.2通過宮腔鏡進行組織取樣 女性在月經(jīng)期干凈后，接受宮腔鏡探查術后，對子宮內(nèi)可疑感染組織進行取樣，在進行取樣操作時，為避免陰道內(nèi)細菌的污染，對外陰清洗后放置窺陰器，之后對宮頸口進行碘伏擦洗消毒。組織取出后不要碰到陰道壁。將標本分為2份，1份用于病原體檢查(病原體培養(yǎng)標本直接送檢，用于mNGS標本放于細胞保存液中，2～8 ℃保存送至實驗室)，另外1份用福爾馬林進行固定，用于病理學檢查和免疫學檢查。

1.3微生物培養(yǎng) 細菌及真菌培養(yǎng)：標本分別接種在巧克力瓊脂平板、麥康凱平板和哥倫比亞血瓊脂平板、沙保羅平板(鄭州安圖公司)，對其實施分區(qū)劃線進行接種。在 35 ℃及5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行需氧培養(yǎng)，放入?yún)捬醮鼌捬?法國生物梅里埃)培養(yǎng)，孵育時間為48～72 h。

1.4mNGS

1.4.1標本處理和DNA提取 取子宮內(nèi)膜活檢標本，超聲破碎后，按照TIANamp Micro DNA kit(DP316，天根生化科技有限公司，中國)試劑盒步驟提取DNA。

1.4.2文庫構建和測序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)控文庫插入DNA片段，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(ThermoFisher，美國)按操作說明對DNA文庫濃度進行質(zhì)控分析，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復制生成DNA納米球(DNB)。制備好的DNB加載到測序芯片，使用BioelectronSeq4000進行測序。測序數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量和長度小于35 bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，通過比對，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。去除低復雜度序列后與微生物大數(shù)據(jù)庫比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲進行分類排列。

1.5CE治療 確診為CE患者，根據(jù)病原微生物的檢測結果進行相對于的治療。如對革蘭陽性細菌感染采用阿莫西林聯(lián)合克拉維酸治療，對革蘭陰性細菌感染采用環(huán)丙沙星治療，對支原體感染采用交沙霉素治療。而對于病原體檢測陰性的患者采用廣譜抗菌藥物治療，如采用多西環(huán)素、甲硝唑和頭孢曲松聯(lián)合治療[11]。在治療后的卵泡期，所有患者再次進行宮腔鏡檢查和病理學檢查。如果宮腔鏡和病理學檢查結果均正常，則治療結果，患者判斷為治愈，治療時間不超過3個月。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)比對主要采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1組1、組2微生物檢測陽性率比較 組1微生物檢測陽性患者17例，陽性率為20.00%；組2微生物檢測陽性患者43例，陽性率為79.63%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在本研究中陽性結果表示微生物置信度中度以上，置信度水平由微生物鑒定宏基因組通道技術(MAPMI)內(nèi)置模型計算得出。高置信度指確定標本中客觀存在檢出物種，如圖1中顯示高度置信金黃色葡萄球菌感染；中置信度指大概率確定標本中客觀存在檢出物種，如圖2中顯示中度置信銅綠假單胞菌感染。疑似結果指不太確定標本中是否存在檢出物種，本研究中不納入陽性結果，如圖3中顯示疑似解脲脲原體感染。

注：本次檢查參考序列來源于金黃色葡萄球菌GCA_000626615.3,標本覆蓋率為84.37%，平均深度為11.0×(測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值)。

注：本次檢查參考序列來源于銅綠假單胞菌GCA_00478465,標本覆蓋率為0.54%，平均深度為1.4×(測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值)。

注：本次檢查參考序列來源于解脲脲原體GCA_000828735.1,標本覆蓋率為0.34%，平均深度為1.1×(測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值)。

2.2組1、組2病原體檢出頻率比較 組1的85例患者中，陽性結果為17例。其檢測出的全部是常見的條件致病菌，如肺炎克雷伯桿菌3例、大腸埃希菌3例、鏈球菌4例、解脲脲原體2例，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、人型支原體各1例，未檢出合并感染情況。組2的54例患者中，陽性結果為43例；除了檢測出的常見的條件致病菌外，還檢測出了多例常規(guī)培養(yǎng)中不易發(fā)現(xiàn)的細菌和病毒，如肺炎克雷伯桿菌6例，大腸埃希菌、鏈球菌、脆弱桿菌各5例，解脲脲原體4例，陰道加德納菌、糞腸球菌、變形桿菌、人型支原體各3例，金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、普雷沃菌、結核分枝桿菌各2例，檢測出病毒如巨細胞病毒5例、人乳頭狀瘤病毒3例，人型皰疹病毒2例及細環(huán)病毒1例。組2中有12例患者同時檢測出了細菌和病毒、支原體。

2.3兩組CE治愈率比較 組1的85例患者中，有44例患者治愈，治愈率為51.76%；組2的54例患者中，有43例患者治愈，治愈率為79.63%。組2的治愈率顯著高于組1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

在不孕不育的患者中，CE的發(fā)病率較高。引起CE的一個主要因素就是微生物感染。研究者們從CE患者子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)了多種不同類型的微生物，有需氧菌、微需氧菌、厭氧菌、支原體、衣原體及病毒等[12-13]。由于微生物的特性及耐藥性的不同，子宮內(nèi)膜炎患者需要不同的用藥方案進行治療?？咕幬锏拿つ渴褂脮斐扇松眢w內(nèi)微生物菌群的失調(diào)及增加細菌的耐藥性，更不利于胚胎的著床和發(fā)育。

因此，如何有效地檢測出女性宮腔內(nèi)的致病微生物并對其進行治療，在輔助生殖技術中有著非常重大的意義。大多數(shù)學者使用微生物培養(yǎng)方法，很少有學者用mNGS技術去研究子宮內(nèi)膜病原微生物及對CE治愈率的影響。

本研究結果顯示，微生物培養(yǎng)的方法微生物陽性率為20.00%，與文獻[14-15]報道結果相似；mNGS的方法微生物陽性率為79.63%，顯著要高于微生物培養(yǎng)方法。對比了兩組檢出微生物類型，結果顯示微生物培養(yǎng)檢出的微生物主要以常規(guī)的條件致病菌為主，如肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、支原體等，而在mNGS組中，除了發(fā)現(xiàn)了這些常規(guī)的條件致病菌外，還發(fā)現(xiàn)了較多用常規(guī)培養(yǎng)的方法難以檢測的病原體，如脆弱桿菌、普雷沃菌、結核分枝桿菌和病毒等。mNGS檢測在微生物檢測上的應用優(yōu)勢在于其有著較廣的覆蓋范圍，且能檢測到一些難以發(fā)現(xiàn)的病原體。本研究結果中，通過mNGS檢測，顯著提高微生物的陽性率，有效地檢測出多種罕見的病原體和多種病原體混合感染的情況。本研究結果顯示，在治療3個月后，組2的治愈率顯著高于組1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究的治愈率高于文獻[16]的報道結果。

自從mNGS首次被用于臨床病原學診斷后，其應用也越來越廣泛。很多研究結果表明其在特異度無差別的情況下，能顯著提高檢測的靈敏度[17]，很適用于臨床上不明、少見及不典型癥狀的檢測。在本研究中，利用mNGS技術診斷，得到了較好的臨床結局，但是廣泛應用于CE的診斷，仍然存在不少的挑戰(zhàn)。如在采集過程中對無菌操作要求較高；mNGS技術對實驗室要求較高，能開展的實驗室較少；相對于普通的培養(yǎng)和PCR檢測，mNGS花費較高，部分患者難以接受。因此，mNGS雖然能顯著提高CE的微生物檢驗效率，仍然需要更多的研究來提高mNGS在臨床上的可操作性，以及技術上的革新來降低檢測成本。

綜上所述，對于CE患者利用mNGS的方法，能顯著提高患者子宮內(nèi)膜微生物檢測的陽性率，并且進行針對性的藥物治療后，能顯著提高CE患者的治愈率。雖然目前在臨床全面應用還存在一定困難，但mNGS作為一種新型的微生物檢測手段，對子宮內(nèi)膜微生物檢測有較大的應用價值和應用前景。