血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平預測卵巢癌患者預后的臨床價值

裴 培，郭春蓮，高丹鳳

上海市同仁醫院婦產科，上海 200050

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，由于位置較深，沒有特異性的檢測手段，確診時70%以上的患者已經發展為晚期，其5年生存率為30%～40%，因此要改善患者的預后，早發現、早診斷和早治療顯得尤其重要[1-2]。微小RNA(miRNA)是一種轉錄后的調控因子，在腫瘤的發生、發展和預后均有很重要功能，現有研究證實腫瘤的發生、發展與miRNA的失衡具有重要聯系[3-4]。現有研究證實，miR-221-3p參與了多種腫瘤的發生、發展，在卵巢癌患者的血清中出現異常增高[5]，而在腫瘤的臨床病理和預后方面的研究甚少。miR-451a在多種腫瘤中出現異常表達，對腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移具有明顯的抑制作用，同樣發現在卵巢中出現低表達[5]，與miR-221-3p相對表達水平是否具有內在聯系仍不清楚。本研究通過檢測卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平，觀察其在卵巢癌預后中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年12月在本院就診且病理診斷為卵巢癌的患者110例(卵巢癌組)作為研究對象。卵巢癌患者年齡為45～79歲，平均(61.54±8.65)歲；按照病理類型分為漿液性腺癌57例，非漿液性腺癌53例；按照分化程度分為低分化18例、中分化68例和高分化24例；按照國際婦產科協會(FIGO)分期分為Ⅰ期13例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例和Ⅳ期17例。選取同期在本院經病理證實的良性卵巢腫瘤患者75例作為卵巢良性組，年齡為45～79歲，平均(61.38±6.75)歲。選取同期在本院行體檢的女性健康者45例作為健康對照組，年齡為45～79歲，平均(60.96±5.81)歲。納入標準：(1)卵巢癌組和卵巢良性組均經病理證實；(2)均為初次就診；(3)所有的患者均未接受放化療；(4)均知情同意，簽署知情同意書；(5)經醫院倫理委員會審核通過。排除標準：(1)患其他惡性腫瘤；(2)患血液性和免疫性疾病；(3)患肝炎、結核和急慢性肺炎等感染性疾病；(4)患嚴重的內科疾病。各組年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1隨訪 所有卵巢癌患者均接受隨訪3年，根據患者是否死亡分為生存組(79例)和死亡組(31例)。

1.2.2血液標本保存和檢測 卵巢癌組入院后和手術后1周抽取肘靜脈血2 mL。采用離心機將血液離心，離心半徑15 cm，離心速度3 000 r/min，離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內，放置在-70 ℃冰箱中保存。

1.2.3實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) (1)總RNA抽取：采集受試者血清400 μL，采用TaqMan miRNA試劑盒提取血清總RNA，反轉錄引物由上海化生有限公司合成。miR-221-3p上游引物序列為5′-CCT GAG ATG CAG GGT CCG AGG TAG GTC TA-3′，下游引物序列為5′-TTG CGG ACA TTG CTT GCT A-3′。miR-451a上游引物序列為5′-ATT GCT TGT CTC GGT CTG-3′，下游引物序列為5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CTT ACA G-3′。U6的上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。(2)miRNA檢測：選擇反轉錄酶1 μL，RNA5 μL和3 μL引物，在15 μL的反應體系中，采用美國ABI TaqMan PreAmp Master Mix進行擴增，擴增條件：16 ℃30 min，42 ℃反應30 min和85 ℃反應5 min。取反轉錄配制20 μL反應體系，放置在熒光定量儀中進行反應，反應條件為95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續40個循環。每個樣品檢測3次，以2-ΔΔCt表示。

1.3觀察指標 觀察各組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平的變化，卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平在術前和術后的變化，以及其與臨床指標[年齡、腫瘤最大徑、組織分型、分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、糖類抗原125(CA125)]和預后的關系。

2 結 果

2.1各組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平比較 卵巢癌組血清miR-221-3p相對表達水平明顯高于卵巢良性組和健康對照組,而卵巢良性組血清miR-221-3p相對表達水平高于健康對照組,差異均有統計學意義(P<0.05);卵巢癌組術后血清miR-221-3p相對表達水平較術前明顯降低,差異有統計學意義(t=11.785，P<0.05)。卵巢癌組血清miR-451a相對表達水平較卵巢良性組和健康對照組明顯降低，而卵巢良性組血清miR-451a相對表達水平明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05);卵巢癌組術后血清miR-451a相對表達水平較術前明顯升高，差異有統計學意義(t=10.833，P<0.05)。見表1。

表1 各組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平比較

2.2卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平與臨床指標的關系 卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和CA125水平患者間比較，差異有統計學意義(P<0.01)，而在不同年齡和組織分型患者間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平與臨床指標的關系

2.3卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平之間的相關性 卵巢癌患者血清miR-221-3p相對表達水平與血清miR-451a相對表達水平呈負相關(r=-0.648，P<0.01)。

2.4卵巢癌患者隨訪3年血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平與預后的關系 卵巢癌組術后隨訪3年，生存組血清miR-221-3p相對表達水平明顯低于死亡組，差異有統計學意義(P<0.05)，而生存組血清miR-451a相對表達水平明顯高于死亡組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 生存組和死亡組血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平比較

2.5聯合檢測在預測患者3年內出現死亡的效能分析 血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平在預測卵巢癌患者3年內出現死亡具有較高的效能，根據患者3年內是否出現死亡進行Logistics回歸得方程Y=2.46×XmiR-221-3p-2×XmiR-451a-4.49得聯合檢測指標，聯合檢測其靈敏度為87.1%，特異度為91.1%，兩者聯合檢測的ROC曲線下面積(AUC)為0.929，明顯高于miR-221-3p(Z=2.016，P<0.05)和miR-451a(Z=2.543，P<0.05)單項檢測的AUC，而血清miR-221-3p和miR-451a的AUC比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表4。

圖1 聯合檢測在預測卵巢癌患者3年內出現死亡的AUC比較

表4 聯合檢測在預測患者3年內出現死亡的效能分析

3 討 論

卵巢癌由于位置在盆腔的深部，早期沒有明顯的癥狀，多數患者在確診時已經是晚期，5年存活率較低。卵巢癌患者預后差的重要因素是早期診斷較為困難，并且化療容易耐藥和容易出現復發。目前診斷卵巢癌的常規方法主要有經陰道超聲、盆腔CT和CA125，但由于這些檢查方法的靈敏度和特異度較低，對于早期發現卵巢癌的臨床價值受限[6]。現越來越多的研究表明循環中的miRNA在臨床多種腫瘤的診斷和預后判斷中具有重要的臨床價值，與腫瘤的發生、發展和轉移同樣具有密切相關性，在卵巢癌診斷和預后判斷方面同樣具有極高的臨床價值。

miR-221-3p是一個重要的促癌基因，在多種腫瘤如宮頸癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等呈高表達，且其相對表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關。miR-221-3p通過靶向THBS2的表達，促進宮頸鱗狀細胞癌的血管生成，促進宮頸癌的遷移和浸潤[7]；在前列腺癌的研究中發現miR-221-3p促進SOX4的表達，促進腫瘤的增殖和轉移[8]。在胃癌中的研究中表明血清miR-221-3p相對表達水平與腫瘤分期和淋巴轉移密切相關，在胃癌的預后預測中具有重要臨床價值[9]；在胰腺癌的研究中發現miR-221-3p相對表達水平明顯升高，是胰腺癌潛在的生物學指標[9]。本研究發現卵巢癌組血清miR-221-3p相對表達水平明顯高于卵巢良性腫瘤組和健康對照組，卵巢癌組術后血清miR-221-3p相對表達水平較術前明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)，說明血清miR-221-3p來自腫瘤部位，與腫瘤具有密切相關。有研究顯示miR-221-3p能夠通過調節ARF4靶基因的表達，從而促進內皮卵巢癌的增殖和遷移[10]。本研究結果顯示，血清miR-221-3p相對表達水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和CA125水平卵巢癌患者間比較，差異有統計學意義(P<0.01)，說明血清miR-221-3p相對表達水平反映卵巢癌的惡性程度和腫瘤的分期，與文獻[11]報道結果類似。本研究顯示，當血清miR-221-3p相對表達水平>2.73時，其預測3年內發生死亡的靈敏度為77.4%，特異度為84.8%，而AUC為0.859，說明血清miR-221-3p相對表達水平在預測卵巢癌預后具有較高的價值。

miR-451a近年來研究較多的miRNA之一，與多種腫瘤的生物學行為具有密切關系。在肝癌的研究中發現miR-451a能夠通過干擾YWHAZ基因的表達，對FOX03蛋白細胞核內的聚集進行調節，從而抑制腫瘤的生長[12]；在胰腺癌的研究發現miR-451a能夠作用于CDKN2D和MAP3K1靶基因，從而抑制腫瘤細胞的增殖[13]；miR-451a可以通過干擾CCND2基因的表達，抑制細胞增殖和遷移，促進乳腺癌的細胞凋亡，改善對腫瘤細胞的耐藥性，并發現miR-451a可以作為乳腺癌預后的預測因子，對乳腺癌的預后具有預測作用[14]；在另一項研究證實轉染miR-451a后，對胃癌和結直腸癌細胞株的增殖、分化和轉移具有明顯抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用，從而抑制腫瘤的發生、發展[15-16]。本研究表明卵巢癌患者血清miR-451a相對表達水平明顯低于卵巢良性組和健康對照組，卵巢癌組術后血清miR-451a相對表達水平較術前明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明miR-451a對卵巢癌具有保護作用，是一種抑制基因，與文獻[17]報道結果類似。本研究結果顯示，血清miR-451a相對表達水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和CA125水平卵巢癌患者間比較，差異有統計學意義(P<0.01)，說明血清miR-451a相對表達水平是卵巢癌的預后指標。隨訪3年發現，卵巢癌生存組血清miR-451a相對表達水平明顯高于死亡組，說明血清miR-451a相對表達水平與預后明顯相關，當血清miR-451a相對表達水平≤1.43時，其預測3年內發生死亡的靈敏度為96.8%，特異度為73.4%，AUC為0.820，說明血清miR-451a相對表達水平在預測卵巢癌患者3年內發生死亡具有較高的效能。

本研究結果顯示，卵巢癌患者血清miR-221-3p相對表達水平與miR-451a相對表達水平呈負相關，兩者存在某種內在聯系，miR-221-3p作為癌基因對癌細胞的生長具有促進作用，而miR-451a基因作為一種抑癌基因抑制腫瘤的生長，其具體機制需要進一步研究。本研究發現，聯合檢測miR-221-3p和miR-451a相對表達水平能夠提高對卵巢癌患者3年內出現死亡的預測效能，其靈敏度高達87.1%，特異度為91.1%，其AUC明顯高于miR-221-3p和miR-451a單項檢測，說明兩個指標之間存在某種互補性，能夠提高預測卵巢癌患者3年內發生死亡的效能，為卵巢癌患者是否采取進一步干預措施提供理論依據，對卵巢癌患者術后適度治療具有重要的臨床指導意義。

總之，血清miR-221-3p和miR-451a相對表達水平在預測卵巢癌患者預后中具有重要的臨床價值，聯合檢測能夠明顯提高預測效能。