PD-L1和PD-1在T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結中的表達情況及與預后相關性研究

程 璐，徐琪超，梅 舟，徐 哲

蘇州大學附屬常州老年病醫院/常州市第七人民醫院:1.檢驗科;2.血液腫瘤科，江蘇常州 213000；3.常州市第二人民醫院檢驗科，江蘇常州 213000

結直腸癌作為較為常見的惡性腫瘤之一，目前已成為全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。隨著人們飲食、環境的不斷改變，其發病率也呈持續上升趨勢，且患者術后多出現復發情況[2]。有研究顯示[3]，我國經確診為結直腸癌的患者中，20%～25%患者發生復發和癌旁轉移。目前，主要通過手術、化學藥物方法進行治療，并取得了一定的效果，但既往治療對于癌旁轉移認識不足，因此導致術后易復發，影響預后，因此，針對免疫系統的抗癌療法對于治療結直腸癌具有重要意義，程序性死亡受體 1(PD-1)，程序性死亡配體 1(PD-L1)作為免疫系統負向調節因子在抗腫瘤免疫領域中起到了至關重要的作用[4-5]。因此本研究旨在探討PD-L1和PD-1在T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結中的表達情況及與預后的相關性，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2021年5月常州市第七人民醫院收治的80例T4期結直腸癌患者，41例男性、39例女性；年齡34～86歲，平均(63.54±3.82)歲；按國際抗癌協會分類標準進行組織學分級：G1級12例、G2級49例、G3級19例。隨訪12個月。

1.2儀器與試劑 采用日本OLYMPULS公司BX51 顯微鏡進行細胞免疫組化染色結果觀察并拍照。PD-1 抗體和 PD-L1 抗體均購于福建邁新生物技術有限公司，濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(產品編號 DAB-0031)購于邁新公司，免疫組化廣譜(EliVision TM plus)試劑盒(產品編號 KIT-9903)購于邁新公司。

1.3方法 對PD-L1、PD-1實施蛋白免疫組化檢測，應用標準鏈霉親和過氧化物酶，將組織切片放在特定濃度一抗中一晚，隔天，將組織切片放入羊抗兔 lgG 內孵育 30 min，再將組織切片轉移至經過氧化酶標記的鏈霉親和素室溫孵育 20 min。用50 μL TrisHCL 緩沖液 (pH=7.6)將切片染色，并放置于顯微鏡下觀察約 6 min，再用水沖洗，最后用蘇木素進行染色，用1%鹽酸酒精分化、氨水返藍梯度酒精脫水、吹干、封片處理。

1.4觀察指標 所有組織采用常州市第七人民醫院病理科病理組織庫中保存的結直腸癌患者癌及管狀腺瘤組織蠟塊。采用DAKO Hercept Test 評分，PD-L1 和 PD-1陽性顯色：細胞漿呈現黃色至黃褐色顆粒。采用半定量積分法來表達PD-L1 和 PD-1，評分指標結合染色強度和陽性細胞百分比，選擇5個視野進行觀察。染色強度：不著色提示0分；淺黃色提示1分；棕黃色提示2分；棕褐色提示3分，顏色越深，分值越高。陽性細胞百分比：低于0%～<10%為1分； 10%～<50%為2分；≥50%為3分。染色強度和染色的陽性細胞計數乘積小于3分為陰性，反之則為陽性。所有免疫組化切片由2名研究者獨立進行判斷評估，若結果不一致時，則重新共同觀察確定。總生存期是指從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間；無進展生存期是指隨機化到患者出現腫瘤進展或死亡的時間。根據檢測出的陽性細胞數確定高表達、中度表達及低表達，其中低表達為陽性細胞數>20%，中度表達陽性細胞數>40%，高表達陽性細胞數>65%。

2 結 果

2.1PD-LI、PD-1在總生存期和無進展生存期中的表達率比較 PD-L1、PD-1高表達患者總生存期和無進展生存期表達率與PD-L1、PD-1中度表達和低表達患者比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PD-LI、PD-1在總生存期和無進展生存期中的表達率比較[n(%)]

2.2T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者PD-L1表達率比較 T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者中檢測到54例 PD-L1表達，其中高表達38例(70.37%)、中度表達10例(18.52%)、低表達6例(11.11%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者PD-L1表達率比較[n(%)]

2.3T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者 PD-1表達率比較 T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者中檢測到54例PD-1表達，其中高表達38例(70.37%)、中度表達10例(18.52%)、低表達6例(11.11%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者PD-1表達率比較[n(%)]

2.4PD-L1、PD-1表達與結直腸癌預后關系 淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分級對PD-L1、PD-1表達存在影響。見表4。

表4 PD-L1、PD-1表達與結直腸癌預后關系

3 討 論

結直腸癌作為世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一[6]，目前主要采取手術、放化療及藥物控制等治療手段。隨著醫療技術的不斷進步，不斷地有新型化療藥物及分子靶向藥物運用到臨床，并取得了顯著的成果，但因結直腸癌而死亡的患者人數仍占多數，且患者術后情況不容樂觀[7-8]。當前免疫療法已成為治療腫瘤的重要策略，而免疫耐受現象則成為了腫瘤免疫療法的主要障礙，癌細胞在癌變部位通過各類機制對自身進行保護，通過上調免疫抑制性分子PD-Ll表達而達到逃避機體免疫反應的目的[9-10]。

PD-L1作為凋亡相關蛋白在免疫應答中發揮至關重要的作用，在免疫應答中，PD-L1對其配體PD-1和淋巴細胞結合起到誘導作用，進而傳遞給T淋巴細胞其抑制信號，最終起到調節外周T細胞免疫耐受的作用[11-12]。 PD-L1、PD-1通路及腫瘤免疫逃避系統在治療過程中受到破壞，T細胞的免疫功能將會增強，引起腫瘤細胞分解，從而達到治療效果[13-14]。有研究表明[15]，PD-L1、PD-1能夠廣泛表達在多種腫瘤組織中，但PD-L1、PD-1在結直腸癌患者中的表達及與預后的相關性尚待商榷。本研究結果顯示，PD-L1、PD-1高表達患者總生存期和無進展生存期表達率與PD-L1、PD-1中度表達和低表達患者比較，差異有統計學意義(P<0.05)。T4期結直腸癌組織及周圍轉移淋巴結患者中檢測到分別有54例PD-L1和PD-1表達；淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分級對PD-L1、PD-1表達存在影響。文獻[16]與本研究結果一致，PD-L1的表達能夠作為腫瘤預后的重要指標。本研究結果初步證實了PD-L1、PD-1可能成為結直腸癌治療的關鍵靶點。PD-L1不僅能夠作為PD-1的配體在腫瘤環境中發揮作用，還能夠傳遞負性信號，阻止腫瘤細胞凋亡并抵抗細胞毒性T細胞介導的細胞溶解。同時，PD-L1還具有誘導T細胞耗竭及相關的抗原提呈細胞功能的缺失，聚集調節性T細胞的作用[17]。有研究顯示PD-1、PD-L1通路不僅能夠調節腫瘤免疫，同時在腫瘤發生、生長、轉移過程中也發揮著不可或缺的作用。最近，有學者通過研究PD-1在黑色素瘤細胞表面的表達情況發現，這些黑色素瘤細胞能夠通過激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路來促進自身增殖[18]。

綜上所述，PD-L1、PD-1表達在結直腸癌中上調，與淋巴結轉移有關，可作為轉移、侵襲性結直腸癌的新型生物標志物發揮其重要作用。