循環(huán)微RNA生物標(biāo)志物應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

范琳媛，劉朝暉，盧丹

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦科，北京 100026)

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜組織在宮腔以外的部位定植和生長(zhǎng)，多發(fā)生于盆腔直腸子宮陷凹及卵巢表面，好發(fā)于25～35歲的育齡人群[1]。異位的內(nèi)膜組織及其引起的炎癥可導(dǎo)致嚴(yán)重痛經(jīng)、性交痛、卵巢腫塊和不孕，影響患者的生活[2]，全球10%～15%的育齡期女性飽受子宮內(nèi)膜異位癥的困擾[3]。目前臨床診斷子宮內(nèi)膜異位癥的主要方法為腹腔鏡手術(shù)及病理檢查，在因慢性盆腔痛或痛經(jīng)而行腹腔鏡檢查的患者中，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率為30%～50%，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于中晚期，錯(cuò)失早期最佳治療時(shí)機(jī)[4]。因此，尋找特異且敏感的非侵入性診斷方法成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)。微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類大小為18～25 nt的單鏈小RNA，參與人體約30%的基因調(diào)控[5]。miRNA不易被RNA酶降解，可在人體循環(huán)血液、唾液、精液和尿液等體液中穩(wěn)定存在，可作為診斷疾病的標(biāo)志物[6]。現(xiàn)就循環(huán)血液中miRNA的表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系及其用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的問(wèn)題進(jìn)行綜述，旨在為建立便捷、特異的子宮內(nèi)膜異位癥診斷方法提供參考。

1 循環(huán)血液miRNA特點(diǎn)及在疾病診斷中的研究

miRNA是一類非編碼單鏈RNA，主要通過(guò)抑制信使RNA的翻譯或降解信使RNA調(diào)控基因表達(dá)，并參與機(jī)體絕大部分的病理生理過(guò)程，如生物發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和免疫應(yīng)答等[7]。miRNA不僅可以用于疾病的診斷，還可用于疾病的分層和治療[8]。有研究表明，miRNA在人體循環(huán)血液、唾液、精液和尿液等體液中穩(wěn)定存在，復(fù)雜性、組織特異性較低，且沒(méi)有翻譯后修飾，可能作為生物標(biāo)志物[9]。

隨著對(duì)miRNA研究的深入，基于miRNA生物標(biāo)志物的基因診斷和治療已逐漸應(yīng)用于臨床[10]。如miR-146a和miR-223可作為敗血癥的生物標(biāo)志物[11]。鎖核酸技術(shù)修飾的miR-155抑制劑已用于T細(xì)胞淋巴瘤和真菌病的治療[12]。miR-122是丙型肝炎病毒復(fù)制的重要宿主因子，已作為檢測(cè)丙型肝炎病毒的生物標(biāo)志物之一，且miR-122拮抗劑RG-101在抗丙型肝炎病毒方面表現(xiàn)出良好的治療效果[13]。由于miRNA是一個(gè)非常短的核苷酸序列，其鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶水平變化較大，可導(dǎo)致不同的雜交特性，因此對(duì)其檢測(cè)技術(shù)也有較高的要求。

2 循環(huán)miRNAs生物標(biāo)志物與子宮內(nèi)膜異位癥診斷

子宮內(nèi)膜異位癥雖然惡變率較低，但其具有腫瘤細(xì)胞的增生、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的癌樣特征，也被稱為婦科的“良性腫瘤”[14]。目前，腹腔鏡是診斷子宮內(nèi)膜異位癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但并非所有患者均能及時(shí)行手術(shù)探查，故子宮內(nèi)膜異位癥患者的確診和治療通常會(huì)被延誤。來(lái)自國(guó)際10個(gè)國(guó)家16個(gè)研究中心的研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥的確診平均延遲6.7年[15]，而我國(guó)針對(duì)400例子宮內(nèi)膜異位癥患者的研究顯示，其確診平均延遲13.0年[16]。非侵入性檢查的缺乏是造成子宮內(nèi)膜異位癥確診延遲的重要因素，及時(shí)并準(zhǔn)確診斷成為子宮內(nèi)膜異位癥治療的關(guān)鍵。隨著miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的重要作用被發(fā)現(xiàn)，許多與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的循環(huán)血液miRNA標(biāo)志物被逐漸報(bào)道。

2.1miR-17-5p和miR-20a 多項(xiàng)研究顯示，miR-17-5p和miR-20a在子宮內(nèi)膜異位癥患者血液和組織中表達(dá)水平均下調(diào)[17-20]。miR-17-5p、miR-20a、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-91a共同組成miR-17-92簇，在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[17-19]。有研究收集了23例Ⅲ～Ⅳ級(jí)子宮內(nèi)膜異位癥患者和23例正常女性的血液樣本，經(jīng)芯片分析兩組受試者血清中27種miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過(guò)多重方法驗(yàn)證后，miR-17-5p、miR-20a和miR-22的表達(dá)明顯下調(diào)，與檢測(cè)準(zhǔn)確性相關(guān)的受試者工作特征曲線下面積分別為0.74、0.79 和0.85[19]。另有研究比較80例Ⅰ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者和60例非子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miR-17的表達(dá)水平，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miR-17水平明顯下調(diào)(受試者工作特征曲線下面積為0.84)[20]。提示通過(guò)檢測(cè)循環(huán)血液中miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)水平可提高子宮內(nèi)膜異位癥診斷的準(zhǔn)確性。

子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生與細(xì)胞缺氧密切相關(guān)，研究證實(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子均是miR-17-5p/20a的下游靶點(diǎn)，miR-17-5p/20a表達(dá)水平降低可減弱缺氧誘導(dǎo)因子-1α的轉(zhuǎn)錄后抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)缺氧脅迫下細(xì)胞中其他蛋白的生成[21]。此外，缺氧誘導(dǎo)因子-1α可刺激環(huán)加氧酶2的表達(dá)和前列腺素的產(chǎn)生，從而促進(jìn)局部炎癥的發(fā)生[21-22]。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥患者斑塊中的異常血管生成[23]。另有研究表明，miR-20a可作用于抗凋亡蛋白G1/S-特異性周期蛋白D1和核因子E2F3，從而參與異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖并減少其凋亡[24]。以上研究均提示，miR-17-5p和miR-20a可能成為子宮內(nèi)膜異位癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。

2.2miR-200家族 miR-200家族中的miR-200a、miR-200b和miR-141均與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病有關(guān)。研究顯示，與非子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)照者相比，3種miRNA在Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜異位癥患者中表達(dá)水平下降，僅miR-200a在Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者中表達(dá)明顯減少，且miR-200a和miR-200b聯(lián)合診斷的靈敏度更高，可達(dá)90.6%[25]。另有研究比較了子宮內(nèi)膜異位癥患者的原位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)與原位子宮內(nèi)膜相比，miR-200a、miR-200b和miR-141在異位子宮內(nèi)膜中表達(dá)均下調(diào)[26]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的基本過(guò)程之一，在此過(guò)程中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型后突破基膜到達(dá)子宮腔外[27]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要特征是參與細(xì)胞間黏附的相關(guān)蛋白缺失，如上皮鈣黏素。研究證實(shí)，與同位子宮內(nèi)膜相比，腹膜子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞中的上皮鈣黏素表達(dá)下調(diào)或呈現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化特征[28-29]。鋅指E盒結(jié)合蛋白1、鋅指E盒結(jié)合蛋白2和Smad交互蛋白1是上皮鈣黏素的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而miR-200b的下調(diào)可通過(guò)上調(diào)鋅指E盒結(jié)合蛋白1和鋅指E盒結(jié)合蛋白2誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移和子宮內(nèi)膜異位癥的惡性轉(zhuǎn)化[30-31]。

2.3miR-125b miR-125b在子宮內(nèi)膜異位癥患者血液中表達(dá)上調(diào)，有研究將重度子宮內(nèi)膜異位癥患者與正常女性的血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示重癥子宮內(nèi)膜異位癥患者的miRNA表達(dá)譜中有32個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中miR-125b表達(dá)上調(diào)約12倍[32]。這些miRNA的靶基因主要富集于凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、細(xì)胞遷移黏附、表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。同時(shí)，有研究比較了Ⅲ/Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者和非子宮內(nèi)膜異位癥患者血液樣本，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者血液中多個(gè)miRNA表達(dá)變化，其中miR-3613-5p和miR-6755-3p表達(dá)明顯下調(diào)，miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-143-3p、miR-145-5p、miR-451a和miR-18a-5p表達(dá)水平較非子宮內(nèi)膜異位癥患者升高10倍以上，且miR-125b-5p與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性最顯著[33]。在進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的研究中，同樣檢測(cè)到miR-125b-5p、miR-342-3p和miR-451a表達(dá)明顯上調(diào)，通過(guò)構(gòu)建miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p組合算法根據(jù)手術(shù)結(jié)果預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥存在與否，結(jié)果表明所有miRNA均能用于子宮內(nèi)膜異位癥患者和正常人群的區(qū)分診斷，但由于Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此不適用于疾病的進(jìn)展預(yù)測(cè)和疾病分期診斷[34]。以上結(jié)果顯示，采用miR-125b、miR-451a和miR-3613組合檢測(cè)可作為子宮內(nèi)膜異位癥患者的快速診斷方法，且具有更高的準(zhǔn)確性和特異性。

多項(xiàng)研究報(bào)道了miR-125b-5p與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性[35-36]。研究顯示，與正常女性相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者的原位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中腫瘤蛋白p53的表達(dá)水平均降低[37-38]。腫瘤蛋白p53是與人類腫瘤密切相關(guān)的蛋白，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和衰老等生物學(xué)功能密切相關(guān)。子宮內(nèi)膜異位癥患者中腫瘤蛋白p53表達(dá)減少，可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷徙功能增強(qiáng)，即具備癌樣特征[38]。研究顯示，腫瘤蛋白p53與miR-125b表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-125b可能通過(guò)與腫瘤蛋白p53相互作用，參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展[39]。以上研究均證明，miR-125b可在子宮內(nèi)膜異位癥的癌樣特征中發(fā)揮作用。

2.4miR-122和miR-199a 研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥患者血液中的miR-122和miR-199a表達(dá)水平明顯升高，而miR-145、miR-141、miR-542-3p和miR-9表達(dá)水平降低；擴(kuò)大研究顯示，miR-199a、miR-122、miR-145、miR-542-3p與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性較高；進(jìn)一步研究顯示，miR-199a和miR-122的相對(duì)表達(dá)還可以區(qū)分子宮內(nèi)膜異位癥的輕重程度，用于區(qū)分子宮內(nèi)膜異位癥分期，且miR-199a和miR-122還與盆腔粘連和病變分布相關(guān)，miR-199a和miR-122可能參與激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮調(diào)控子宮內(nèi)膜異位病變的作用[40]。

Maged等[41]的研究納入45例盆腔子宮內(nèi)膜異位癥患者和35例因盆腔疼痛行腹腔鏡檢查但未診斷為子宮內(nèi)膜異位癥的患者，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清和腹腔積液中白細(xì)胞介素-6、miR-122和miR-199a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照者，且三者呈正相關(guān)；血清miR-122和miR-199a檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥的靈敏度分別為95.6%和100.0%，特異度分別為91.4%和100%。有研究表明，miR-199a可能通過(guò)靶向IκB激酶β調(diào)控子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的侵襲性，并通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑調(diào)控子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的血管生成潛能[42]。以上研究證明，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miR-122和miR-199a可能是快速診斷子宮內(nèi)膜異位癥的主要分子之一。

目前，多個(gè)研究均報(bào)道了可能用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的循環(huán)血液生物標(biāo)志物miRNA，見(jiàn)表1。總結(jié)各研究結(jié)果，子宮內(nèi)膜異位癥患者血液中miR-125b-5p、miR-17、miR-200家族、miR-122和miR-199a可能作為子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)生物標(biāo)志物候選，但由于各研究臨床樣本選取及實(shí)驗(yàn)方法有所差異，還未得出公認(rèn)的診斷子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)生物標(biāo)志物。有研究提示，若將多個(gè)miRNA組合，其敏感性和特異性可能更高[43-45]，見(jiàn)表1。

3 循環(huán)血液miRNA生物標(biāo)志物應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥的挑戰(zhàn)

目前，雖然子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)miRNA研究已取得一定進(jìn)展，但將循環(huán)血液中miRNA應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥的診斷還面臨很多挑戰(zhàn)。

3.1非一致性結(jié)果 造成研究結(jié)果不一致的原因較多，除結(jié)果分析時(shí)人為因素的干擾，更多由于研究設(shè)計(jì)的不一致性，如對(duì)照組選擇的差異性、標(biāo)本病理階段的差異性和內(nèi)參選擇的差異性。既往的子宮內(nèi)膜異位癥研究中，關(guān)于對(duì)照的選擇不同，部分研究選取腹腔鏡診斷排除的子宮內(nèi)膜異位癥患者，部分研究選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變患者，也有研究選取健康者作為對(duì)照。已有研究者認(rèn)識(shí)到不同子宮病理/盆腔病理之間的分子相似性有重疊，在關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物的研究中，有必要統(tǒng)一定義對(duì)照組[46]。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生是一個(gè)多階段逐步演變的過(guò)程，研究顯示不同病理階段的子宮內(nèi)膜異位癥患者血液中miRNA表達(dá)水平可能不同，女性月經(jīng)周期對(duì)miRNA水平也會(huì)有一定影響[47]。此外，miRNA的研究最常用的內(nèi)參為U6小核RNA，但有研究提示子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)U6小核RNA表達(dá)發(fā)生明顯變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參的選擇也不同，β-肌動(dòng)蛋白、miR-132、miR-16、miR-30e、miR-99a和miR-103-3p均被作為內(nèi)參[48]。因此，迫切需要尋找穩(wěn)定的內(nèi)參以平衡各研究結(jié)果之間的差異。研究提示，非編碼RNA內(nèi)參基因RNU48、U75和RNU44在惡性子宮內(nèi)膜組織內(nèi)表達(dá)較U6小核RNA更穩(wěn)定[48]。

表1 子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)循環(huán)miRNA標(biāo)志物

3.2研究類型單一 既往關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥miRNA生物標(biāo)志物的研究多集中于實(shí)驗(yàn)層面，這些研究結(jié)果也增加了研究者對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展等機(jī)制的認(rèn)識(shí)，但尚需進(jìn)行更大規(guī)模的前瞻性研究以評(píng)估血清miRNA水平與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系及其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥分期診斷的準(zhǔn)確性。研究顯示，尋找子宮內(nèi)膜異位癥早期診斷的特異性miRNA，需要在高度標(biāo)準(zhǔn)化的樣品收集基礎(chǔ)上進(jìn)行大規(guī)模分類分組的深入研究，并通過(guò)綜合研究結(jié)果建立miRNA診斷模型，對(duì)來(lái)自多個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥中心的患者進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)驗(yàn)證，有助于推動(dòng)子宮內(nèi)膜異位癥領(lǐng)域miRNA診斷的實(shí)現(xiàn)[49]。

4 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)分子方法檢測(cè)疾病相關(guān)基因或生物標(biāo)志物，從而輔助臨床醫(yī)師快速進(jìn)行疾病分型、確定治療方案和分析預(yù)后，此種模式已成為臨床發(fā)展趨勢(shì)。目前已有研究報(bào)道了循環(huán)血液中miRNA在子宮內(nèi)膜異位診斷中的應(yīng)用，但尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)果[50]。這要求研究者重視上述問(wèn)題，不斷完善并深入基礎(chǔ)研究，加強(qiáng)與臨床研究的合作。近期有多篇文獻(xiàn)報(bào)道多個(gè)miRNA組合在子宮內(nèi)膜異位癥診斷中的應(yīng)用，而既往關(guān)于miRNA的大量研究也能增加對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的了解，利于尋找更多的miRNA生物標(biāo)志物組合，促進(jìn)循環(huán)血液中miRNA檢測(cè)早日應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診斷。