miR-200b在糖尿病并發癥中的研究進展

陳培劍，丁明璐，蘇然宇，張雪嬌，李魯新，劉潔婷，馮彪，初彥輝

(牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病由一組復雜的疾病過程引起，是遺傳和環境因素共同作用導致的自身免疫反應代謝性疾病，其特征是由胰島素產生不足(Ⅰ型)或受體細胞對胰島素反應不良(Ⅱ型)而導致的長期高血糖狀態。國際糖尿病聯合會數據顯示，全球18～99歲人群的糖尿病患病人數達4.51億，預計2045年將增至6.93 億[1]。目前，糖尿病的確切病因仍未完全闡明。研究表明，糖尿病發病的潛在機制復雜，可能涉及器官和基因表達水平的變化[2-3]。糖尿病可導致許多并發癥，其急性代謝并發癥包括血糖水平異常升高導致的糖尿病酮癥酸中毒(高血糖癥)和低血糖導致的昏迷(低血糖癥)[4-7]；其慢性并發癥主要以微血管病變為主，如糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，此外，還包括大血管病變，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)、腦卒中等。目前的糖尿病治療手段只能延緩疾病發展[8]。人類細胞中大多數蛋白質的表達在某種程度上受到一種或多種微RNA(microRNA，miRNA/miR)的調節。近年的miRbase版本統計了2 654個人類成熟miRNA的序列[9-10]，其中許多miRNA功能尚未被定義。在基因調控中，各種物種間miRNA的廣泛分布起關鍵作用。隨著科學技術的不斷發展，將有越來越多的miRNA被發現。有研究發現，miRNA參與了約1/3人體基因的調控[11-12]。不同miRNA表達的差異在疾病發生發展及調控中發揮重要作用。miR-200b失調與多種疾病有關，如癌癥、代謝疾病[13]。現就miR-200b在糖尿病并發癥中的作用進行綜述。

1 miR-200b概述

miRNA通過與其靶基因序列配對發揮作用，多數由編碼或非編碼轉錄物的內含子區域編碼，少數由外顯子區域編碼。RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ轉錄miRNA基因。長的一級序列在5′端加帽結構，在3′端被多聚腺苷酸化，衍生的初級轉錄產物miRNA前體(pri-miRNA)被復合體識別，該復合體由核蛋白DiGeorge綜合征關鍵區域8和核糖核酸酶Ⅲ組成。核成熟釋放的一種前體miRNA稱為核酸前體，其通過核輸出蛋白-5轉運到細胞質。pre-miRNA被切割后產生約22個核苷酸的雙鏈miRNA，與Ago蛋白質家族中的Ago2形成一個大的核糖核蛋白效應物復合物，稱為RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，其與Ago2的結合有利于鏈的穩定，過客鏈可被降解，以產生成熟的RISC或作為另一種功能性miRNA[14]。

miR-200b是miR-200家族成員，根據其序列中單個核苷酸的差異分為兩個亞類，miR-141和miR-200a以及miR-200b、miR-200c和miR-429。在人體中，miR-200家族通過第1號、第12號染色體轉錄而來，miR-200b、miR-200a、miR-429來自第1號染色體，miR-200c、miR-141來自第12號染色體。成熟的miR-200b來自miR-200b前體S的3′臂上，在機體中表達較為保守[15]。在不同染色體上，miR-200家族成員的基因存在顯著差異，但其基因調控存在高度重疊。miR-200b在多種細胞中表達，包括卵巢癌細胞、乳腺干細胞、腎系膜細胞和內皮細胞等，調節多種細胞功能，如細胞的增殖、遷移、凋亡和血管生成等[16-19]。miR-200b在糖尿病發病中起重要作用，不同類型糖尿病并發癥中的miR-200b表達亦不同。miR-200b通過作用于不同靶點影響不同的信號途徑，進而影響機體對一些疾病的表達調控，被認為是上皮-間充質轉化的基本調節因子之一。

2 miR-200b與糖尿病并發癥的關系

miRNA與糖尿病并發癥存在密切聯系。血液中miRNA的水平可能預示著疾病的發作，特定miRNA表達與不同病理生理狀態有關，包括糖尿病及其并發癥。有證據表明，miRNA可調節胰島素作用和葡萄糖代謝[20]。例如，空腹血糖受損和2型糖尿病個體的miR-126表達均顯著降低[21]。有研究檢測糖尿病前期和新診斷2型糖尿病受試者miRNA的表達發現，miR-1249、miR-320b和miR-527可能是2型糖尿病易感性的生物標志物[22]，miRNA可調節胰島β細胞的功能，其可能是糖尿病的潛在治療靶點[23]，敲除miR-375小鼠的胰島β細胞質量和葡萄糖刺激胰島素分泌減少，表現為高血糖癥，表明miR-375可能是胰島β細胞功能的重要調節劑[24]。此外，Kloosterman等[25]報道，miR-375在誘導多能干細胞增殖形成胰島細胞的過程中起關鍵作用。miRNA水平的變化在腎纖維化、視力喪失和下肢缺血等長期糖尿病所致并發癥的發展中起作用[26-27]，見表1。

表1 miR-200b介導的靶點在糖尿病并發癥中的作用

續表1

2.1miR-200b與DCM 歐洲心臟學會指出，DCM最廣泛的定義是“在沒有其他心血管疾病的情況下發生的心肌功能障礙”，但由于糖尿病通常與高血壓或缺血性心臟病等其他心血管疾病并存，該定義似乎不切實際。有學者主張將DCM沒有任何高血壓、冠狀動脈疾病、瓣膜疾病或局部缺血癥狀，但出現心力衰竭的心肌疾病歸因于糖尿病[39-40]。DCM在結構水平上表現為左心室增大、心臟纖維化增加、舒張功能和收縮功能均受損[41]。心肌細胞局部纖維化是DCM結構改變的重要標志，也是糖尿病患者發生心源性猝死的主要原因，其特征為舒張期順應性下降和心臟收縮不良，雖然屬于心肌疾病，但其機制與高血壓和冠狀動脈性疾病不同[42]。

內皮細胞損傷是高血糖最初引發的病理生理變化，細胞外基質蛋白的生成與沉積在糖尿病并發癥發展中起主要作用。持續的內皮細胞損傷導致纖維化疾病中血管內皮細胞內皮-間充質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)，這種間充質轉化類似于癌細胞的上皮-間充質轉化進程。EndMT是心肌成纖維細胞的關鍵來源之一，導致細胞外基質蛋白的增加，如CD31、血管內皮鈣黏素表達缺失和間充質標志物波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白表達增加。有研究通過比較鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠、特異性miR-200b轉基因糖尿病小鼠、空轉陰性對照小鼠的心臟組織和心臟內皮細胞發現，鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠存在EndMT的變化，但特異性miR-200b轉基因小鼠的EndMT變化被阻止，糖尿病小鼠心臟組織中轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1、α-平滑肌肌動蛋白等特異性標志物表達上調，過表達miR-200b后，EndMT進程被抑制。研究發現，miR-200b介導DCM中的EndMT，miR-200b的過表達也可防止糖尿病引起的心臟功能和結構的改變[28]。

miR-200b與過氧化物酶體增殖物激活受體γ途徑相關，與靶向CD36的miRNA之間存在重疊，DCM組織和心肌細胞中miR-200b顯著下調，而CD36過表達，且CD36的沉默可以抑制通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ途徑的DCM的心肌細胞凋亡。Xu等[29]發現，正常大鼠與糖尿病大鼠心臟中的64個基因存在差異表達，同時鑒定出29個差異表達的miRNA，且CD36與過氧化物酶體增殖物激活受體γ信號通路基因集之間存在重疊；miR-200b以CD36為靶點，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ信號通路調控DCM的心肌細胞凋亡。

2.2miR-200b與DR DR是導致成年人失明的首位原因，DR既往被認為是糖尿病的微血管并發癥，但近年的研究表明，神經變性是DR發病過程中的早期事件[43]，也是糖尿病比較常見且較嚴重的微血管并發癥。DR的發病機制非常復雜，許多因素會導致DR，其表現為氧化應激增加以及視網膜和毛細血管細胞抗氧化防御系統受損等，使血管通透性增加、內皮細胞過度增生和水腫及視網膜血管病理性增生，進而導致視網膜微血管系統的進行性病變。目前DR的發病機制尚不完全清楚[44]。近年來，隨著miRNA在視網膜疾病中研究的不斷深入，miRNA與視網膜疾病的相關性逐漸被揭示。Kovacs等[45]采用鏈脲佐菌素誘導建立1型糖尿病大鼠模型，在其視網膜和視網膜內皮細胞中分別檢出了350種和220種miRNA，其與正常小鼠的120種視網膜內皮細胞miRNA存在差異表達。

Chen等[46]發現，DR和葡萄糖暴露內皮細胞中的p300增加。高血糖誘導的細胞外基質蛋白產生增加是糖尿病內皮功能障礙的特征之一，EndMT是其中的重要機制，此現象已在DCM中被證明。Cao等[31]研究發現，EndMT與上皮-間充質轉化相似，TGF-β是EndMT的關鍵因子，在Smad依賴的途徑中，TGF-β通過誘導Smad、促分裂原活化的蛋白激酶激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和p38/促分裂原活化的蛋白激酶的激活介導EndMT，促使糖尿病視網膜發生EndMT。

miR-200b是DR和糖尿病小鼠中最早發現失調的miRNA之一，miR-200b可以保護血管通透性并防止血管異常生成。在糖尿病中，miR-200b表達下調，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達顯著上調，視網膜血管生成和新血管形成增加。miR-200b表達亦受到多梳抑制性復合物2的調節[32]。VEGFA是一種促血管生成因子，在促進內皮細胞的存活、遷移和增殖以及增強血管滲透性等方面發揮作用[47]。除VEGFA外，VEGF家族其他成員還包括VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盤生長因子[48]。VEGF是人血管生長中不可缺少的物質，尤其是涉及血管和器官重塑的疾病，如傷口愈合、DR[49]。McArthur等[30]報道，在高糖環境下，糖尿病大鼠視網膜和內皮細胞中miR-200b表達下調；該研究對DR患者進行研究發現VEGF基因表達增加，但高血糖誘導細胞損傷的機制仍不清楚。Li等[33]的研究顯示，miR-200b通過下調靶基因VEGFA緩解DR的發展，VEGFA是促進腫瘤血管擴張的主要因素，在早期和晚期DR中具有重要意義。

Han等[34]研究發現，Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)在DR小鼠的視網膜組織中高表達，沉默YAP1可抑制高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞的增殖和遷移，YAP1通過調節長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄子1的表達發揮作用；且熒光素酶實驗證明，長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄子1與miR-200b的相互作用為YAP1沉默通過長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄子1/miR-200b-3p/VEGFA軸減輕DR的發展提供了依據。對Akita小鼠(一種1型糖尿病的遺傳模型)的研究發現，miR-200b調節的抗氧化基因1可能在DR中具有保護作用[35]。另有研究發現，羅通配方對大鼠DR具有保護作用，羅通湯源于抵當湯(黃芪、丹參、三七、訶子、大黃以15∶10∶3∶2∶1的比例進行煎煮)，羅通配方可明顯緩解糖尿病大鼠的組織學異常，且不受血糖水平影響，并可改善血液流變學指標；與未治療糖尿病大鼠相比，使用羅通配方的糖尿病大鼠體內VEGF/VEGF受體和血視網膜屏障的表達降低，色素上皮衍生因子和緊密連接蛋白1/Occludin顯著增加，視網膜miR-200b表達升高[50]。研究表明，miR-200b/c通過抑制血管形成抑制素-2對高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞起保護作用。抑制血管新生可能是治療視網膜血管疾病的潛在治療策略[36]，這為治療DR提供了更多的理論依據和研究方向。

2.3miR-200b與DN DN是糖尿病中較常見的慢性微血管并發癥，是終末期腎病的常見原因，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因，約40%的糖尿病患者合并DN[51-52]。DN的特征是蛋白尿(尿白蛋白與肌酐比值≥30 mg/g)和腎小球濾過率下降，其主要病理特征為腎小球增大、腎小球基膜增厚、系膜細胞增生、腎小管間質擴張、細胞外基質成分(如膠原、纖連蛋白)異常積聚[53]。DN發生分為多個階段，腎小球超濾后的腎功能持續下降通常發生在糖尿病發病后15～20年，并最終發展為腎小球硬化和腎纖維化[54-55]。目前，DN的分子機制仍不清楚，其治療策略是針對血糖和高血壓的基本失調，可延緩疾病發展。

DN涉及多種信號通路，其中PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路與腎纖維化密切相關[56-57]，PI3K/Akt信號通路的激活可以磷酸化Smad3，促進系膜細胞膠原纖維發育，增加腎纖維化的程度[58]。miR-200b表達增加激活下游PI3K/Akt信號通路，導致腎小球肥大和纖維化。Wu等[59]研究發現，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因是miR-200b的靶基因，其可將磷脂酰肌醇三磷酸酯去磷酸化為磷脂酰肌醇二磷酸酯，從而拮抗 PI3K的作用，實現對PI3K/Akt通路的負調節。Yu等[37]研究證明，miR-200b可靶向人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，通過PI3K/Akt通路激活腎臟的纖維化，同時發現金雞菊醇提取物可以改善DN。腎小球肥大是DN的標志。TGF-β1激活的Akt激酶在腎小球系膜肥大中起重要作用。然而，TGF-β激活Akt的機制尚不完全清楚。Kato等[38]的研究發現，TGF-β1誘導的DN相關的胞外信號調節激酶和Akt的激活由miR-200b/c增加導致的GATA結合蛋白2伴侶蛋白下調引起，這可能是導致DN進展中腎小球系膜肥大的新機制。

在DN發展過程中，腎細胞中TGF-β1表達的增加促進了腎臟纖維化和肥大。TGF-β1啟動子受E-box、上游刺激因子的正調控。在小鼠系膜細胞中，miR-200b/c上調TGF-β1水平。1型(鏈脲佐菌素)和2型(db/db)糖尿病小鼠的腎小球以及經體外TGF-β1處理小鼠的腎小球系膜細胞中miR-200b/c水平升高，表明TGF-β1能夠自我調節；且miRNA調控通路可能通過放大TGF-β1信號加快腎臟慢性纖維化的進程，如DN。

3 小 結

miR-200b在糖尿病并發癥(如心血管并發癥、微血管并發癥、DR、DN)中發揮重要作用。在DCM中，miR-200b可誘導內皮細胞向間充質細胞的轉變，并介導CD36激活DCM中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ信號通路，導致DCM發生，此外，miR-200b還可通過調節一些上下游靶點影響DR的發生發展，故可將miR-200b作為糖尿病的治療靶點。目前，不同組織器官中miR-200b的機制可能具有不同的特點，其在糖尿病并發癥進展中的作用尚未闡明。因此，探索miR-200b在糖尿病并發癥中的作用機制有助于研發更高效的抗糖尿病并發癥藥物，未來miR-200b可能成為糖尿病及其并發癥診治的新靶點。