淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的制備及性能研究*

朱肖杰，孟建文△，朱小敏，羅西友，張素文，馬學(xué)彬，楊忠波

(1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101；2. 山東黃河河務(wù)局山東黃河醫(yī)院，濟(jì)南 250032)

1 引 言

止血技術(shù)是外科手術(shù)處理創(chuàng)面的關(guān)鍵技術(shù)，良好的止血材料是臨床手術(shù)成功的關(guān)鍵。目前常用的止血材料有沸石基止血材料[1]、明膠類止血材料[2]、殼聚糖類止血材料[3]以及淀粉基止血材料[4]。

淀粉基止血材料是以淀粉或其衍生物為原材料制備的止血材料[5]，因其良好的生物相容性、無免疫原性、生物可降解性、止血作用優(yōu)異等[6-7]，在戰(zhàn)爭及外科手術(shù)(如術(shù)中加壓、結(jié)扎或其他常規(guī)止血措施無效或無法實(shí)施時)中得到廣泛的研究和應(yīng)用[8]。淀粉基止血材料屬于外源性凝血，通過吸收血液中的水分，使血小板和凝血因子濃縮，增強(qiáng)其凝聚速度和凝聚力，從而提高止血效率。目前臨床上普遍應(yīng)用的AristaTM外科術(shù)中止血裝置是淀粉基止血材料的典型代表[9-10]，市售產(chǎn)品“瞬時”復(fù)合微孔多聚糖止血粉是在淀粉基材上引入羧甲基殼聚糖，增強(qiáng)凝血反應(yīng)，加快止血速度，但殼聚糖作為動物源性材料，免疫原性問題不可避免，可能會誘發(fā)如：結(jié)膜充血、聽力下降、面部麻木、視物模糊、疼痛等神經(jīng)系統(tǒng)的微循環(huán)障礙與組織的缺血缺氧等不良反應(yīng)[11-12]。

海藻酸鹽是一種天然線性多糖聚合物，由(1→4)—β—交聯(lián)的D-甘露糖醛酸和(1→4)—α—交聯(lián)的古洛糖醛酸組成的長鏈聚合物，廣泛存在于海帶及其他褐藻類植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中[13-14]。其生物相容性好，具有抑菌、促愈合等優(yōu)點(diǎn)，已在組織工程、藥物載體等生物醫(yī)用領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[15-16]。大量研究證明，海藻酸類止血材料具有透氧性好，能促進(jìn)組織生長[17-18]，減少疼痛[19]。與殼聚糖相比，其生物相容性好、無免疫原性問題，近年來，被越來越多的應(yīng)用于外科手術(shù)、鼻腔術(shù)后及穿刺部位出血等，效果顯著[20]。

本研究以淀粉和海藻酸鹽為主要基材，制備了淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料，避免了動物源性材料導(dǎo)致的免疫原性問題，既能安全有效地止血，又能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，拓展了多糖類止血材料在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 主要原料和試劑

馬鈴薯淀粉(藥用輔料，安徽山河藥用輔料有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津百世化工有限公司)；海藻酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈣(分析純，上海展云化工有限公司)；液體石蠟(分析純，萊陽市康德化工有限公司)；司班80(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)；環(huán)氧氯丙烷(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；無水乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司)；乙酸乙酯(分析純，山東禹王和天下新材料有限公司)。

2.2 儀器設(shè)備

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電動攪拌器(天津華興偉業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；真空干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠)；SUPRE 55掃描電子顯微鏡(德國Zeiss公司)；Thermo Nicolet iS50傅立葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

2.3 淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的制備

稱取5.0 g司班80于三口燒瓶中，加入1 000 mL液體石蠟，置60℃水浴中攪拌均勻，作為油相備用。將20.0 g馬鈴薯淀粉加入到200 mL水中，置65℃水浴中攪拌糊化20 min，制成淀粉液。將1.0 g海藻酸鈉溶于少量水，加入到淀粉液中并攪拌均勻，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)混合液pH為10，作為水相。將水相緩慢加入到油相中，攪拌至均勻乳液狀后再緩慢滴加1 mL環(huán)氧氯丙烷，攪拌10 min至均勻。將反應(yīng)體系置60℃水浴中，以500 r/min的速度攪拌反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后，稱取1.0 g氯化鈣加少量水溶解，加入到上述體系中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h。

加入300 mL乙醇攪拌至破乳，靜止1 h，倒掉上清液。下層產(chǎn)物加入300 mL乙醇攪拌30 min，過濾。將過濾后顆粒物用乙酸乙酯以同樣方法清洗。乙醇和乙酸乙酯交替清洗產(chǎn)物3次，過濾產(chǎn)物在60℃下干燥3 h，得粉末狀淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料。

2.4 掃描電鏡(SEM)測試

在粉末狀淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料表面進(jìn)行噴金處理，通過SEM觀察止血材料表面的形貌特征。

2.5 紅外光譜測試

用無水 KBr 對樣品進(jìn)行壓片后，通過傅里葉紅外光譜分析儀(FT-IR)分析樣品結(jié)構(gòu)。

2.6 吸液性能測試

取樣品0.1 g于15 mL干燥潔凈離心管中，記為M1，加模擬體液(SBF)[21]10 g，震蕩搖勻，3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。倒出上清液，上清液稱重記為M2，吸水率以式(1)計算。

吸水率=(10-M2)/M1

(1)

2.7 體外凝血測試[22-24]

從健康新西蘭兔上采集新鮮血液，與抗凝管中的檸檬酸鈉立刻混合，混合體積比為1∶9，備用。抗凝兔血、氯化鈣溶液(0.2 mol/L)使用前置37 ℃水浴預(yù)熱。離心管中加入0.6 mL抗凝兔血，將0.02 g樣品和60 μL氯化鈣溶液，同時加入離心管，啟動凝血并開始計時。每10 s倒置觀察，血液完全凝固的時間即為動態(tài)全血凝固時間。所用樣品分別為淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料、海藻酸鹽止血材料、純淀粉止血材料。空白實(shí)驗(yàn)不加樣品，用同樣方法處理。

2.8 大鼠肝臟止血試驗(yàn)

取健康SD大鼠30只，隨機(jī)分為3組，即模型組、供試品組和上市對照品組，每組10只。其中模型組、供試品組、上市對照品組樣品依次為無菌醫(yī)用紗布，淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料，外科術(shù)中止血裝置AristaTM。大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后開腹，暴露肝臟左葉，用組織剪在肝臟左葉中間位置切取大小一致(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)的肝組織，造成敞開型傷口。醫(yī)用紗布迅速擦拭出血創(chuàng)面后，立即將適量供試品直接灑在出血部位，表面覆以無菌紗布和30 g砝碼壓迫止血，每30 s觀察一次，直至止血完成，見圖1。記錄止血時間和出血量。上市對照品做同樣處理。模型對照組使用已精確稱重的無菌醫(yī)用紗布敷壓創(chuàng)口。

出血時間：從出血創(chuàng)面應(yīng)用樣品或紗布到出血完全停止。

出血量(mL)=(止血后紗布重量-止血前紗布重量)/血液比重(1.050 g/mL)

圖1 大鼠肝臟止血試驗(yàn)

3 結(jié)果與討論

3.1 形貌表征

通過SEM觀測淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的形貌特征，其表面呈粗糙、多孔狀，見圖2。該形貌有利于增強(qiáng)對皮膚的黏附和對血液中水分的吸收，從而實(shí)現(xiàn)材料的快速止血性能。

圖2 淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的SEM圖Fig.2 SEM of starch-alginate composite hemostatic material

3.2 紅外光譜分析

對馬鈴薯淀粉、海藻酸鈉、淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料進(jìn)行紅外表征，結(jié)果見圖3。對比馬鈴薯淀粉和淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的紅外光譜圖，馬鈴薯淀粉在977 cm-1處存在伯醇的C—O伸縮振動吸收峰，而淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料在977 cm-1處無吸收峰，說明在C6位的伯醇羥基發(fā)生了反應(yīng)，可能與其空間位阻小有關(guān)[25-26]。海藻酸鈉在1 609 cm-1和1 416 cm-1處存在—COO—的不對稱和對稱伸縮振動，而反應(yīng)后移動到了1 636 cm-1和1 418 cm-1處，說明海藻酸鈉參與了反應(yīng)[27]。

3.3 吸液性能

快速有效的止血材料一般具備強(qiáng)的吸液性能，其在傷口表面一般具有雙重止血機(jī)理：一是可以快速吸收流出的血液并激發(fā)凝血系統(tǒng)，形成生理性血凝塊，有效封堵傷口；二是通過吸水膨脹產(chǎn)生內(nèi)吸力，吸附有形成分[28]，形成機(jī)械性血凝塊，達(dá)到快速的止血效果[29-30]。本研究測試了海藻酸鹽止血材料、純淀粉止血材料和淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料對模擬體液的吸液率[31]，見圖4。海藻酸鹽止血材料和純淀粉止血材料對模擬體液的吸液率分別為6.22倍和10.94倍，淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料吸收能力最強(qiáng)，吸液倍率為21.32倍，是海藻酸鹽止血材料的3.42倍，是純淀粉止血材料的1.95倍，表明了淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料優(yōu)異的吸液性能。這種高吸液性能可能是由于海藻酸鹽中含有大量的羧基，親水性強(qiáng)，在淀粉的基礎(chǔ)上引入海藻酸鹽，增強(qiáng)了淀粉的親水性，從而提升了材料的吸液性能[32]。

圖3 馬鈴薯淀粉、海藻酸鈉和復(fù)合止血材料的紅外光譜圖Fig.3 Ir spectra of potato starch, sodium alginate and composite hemostatic materials

3.4 體外凝血

本研究分別將淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料、海藻酸鹽止血材料和純淀粉止血材料進(jìn)行體外凝血測試，其動態(tài)全血凝固時間見圖5。與空白全血凝固時間185 s相比，海藻酸鹽止血材料平均全血凝固時間為169.3 s，時間縮短了8.49%；純淀粉止血材料平均全血凝固時間為165.7 s，時間縮短了10.43%；而淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料樣品的平均全血凝固時間為132 s，時間縮短了28.65%，說明該材料有加速凝血的作用，是一種性能優(yōu)異的止血材料。

圖4 吸液性能測試圖 Fig.4 Test diagram of suction performance

淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料的制備過程中，先加入馬鈴薯淀粉和海藻酸鈉，交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，加入氯化鈣，氯化鈣中的鈣離子和反應(yīng)體系中的鈉離子發(fā)生置換[33-34]，以海藻酸鈣的形式存在，海藻酸鈣可促進(jìn)紅細(xì)胞聚集[35]，形成血栓[36-37]。鈣離子在凝血過程中被稱為凝血因子Ⅳ，可與其他凝血因子將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，參與到內(nèi)外源性凝血途中的多個環(huán)節(jié)。在純淀粉止血材料的基礎(chǔ)上引入海藻酸和鈣離子，加速凝血進(jìn)程，提高止血速度，止血性能得到進(jìn)一步提升[20]。

圖5 動態(tài)全血凝固時間 Fig.5 Dynamic whole blood coagulation time

3.5 大鼠肝臟止血

大鼠肝臟止血試驗(yàn)按照2.8所述方法進(jìn)行。結(jié)果見圖6。

圖6 大鼠肝臟止血試驗(yàn)

與模型組相比，供試品組可縮短大鼠肝臟創(chuàng)面止血時間57.9%，出血量減少64.3%。相比于上市對照品組，供試品組大鼠肝臟創(chuàng)面止血時間縮短9.0%，出血量減少43.6%，止血效果比市售產(chǎn)品有一定的提高。

4 結(jié)論

本研究采用反相乳液法得到淀粉-海藻酸鹽復(fù)合止血材料。該材料呈粗糙多孔狀，吸液性能優(yōu)異，對模擬體液吸液率達(dá)20～22倍。體外凝血測試時，凝血時間比空白縮短了28.65%。大鼠肝臟止血試驗(yàn)表明，該材料與無菌醫(yī)用紗布和市售產(chǎn)品AristaTM相比，止血時間分別縮短了57.9%和9.0%，出血量分別減少64.3%和43.6%，明顯縮短了創(chuàng)面的凝血時間，減少了出血量，是一種快速有效的止血材料。該材料在外科手術(shù)等臨床應(yīng)用中，具有良好的前景。