中國南瓜CmNPR1基因的克隆和表達分析

陳培雯，張 立，陳學進，李新崢，李慶飛*

(1 河南科技學院 園藝園林學院，河南新鄉453003；2 河南省園藝植物資源利用與種質創新工程研究中心，河南新鄉 453003)

病程相關基因非表達子(nonexpressor of pathogenesis related genes1，NPR1)是植物系統獲得性抗性防御反應的關鍵調控因子，最早發現于擬南芥突變體中，并以其突變體npr1的表型命名[1-4]。NPR1蛋白包含典型的錨蛋白重復序列(ankyrin repeats，簡稱ANK)結構域和BTB /POZ(broad-complex，tramtrack，and bric-a-brac /poxvirus and zinc-Finger)結構域，其結構域與蛋白和蛋白之間的互作密切相關。擬南芥NPR1的ANK結構域介導其與Basic Domain/Leucine Zipper轉錄因子TGA的相互作用，在ANK突變體中無法形成NPR1-TGA復合體，且不能誘導病程相關基因(PR)的形成，其共激活需要BTB/POZ結構域和C端半胱氨酸的氧化[5-7]。NPR1通過BTB/POZ結構域與乙烯受體蛋白(ethylene insensitive3，EIN3)相互作用，干擾EIN3與靶基因啟動子的結合，從而阻礙頂端彎鉤的形成[8]。N端的BTB/POZ結構域可與C端的反式激活結構相互作用抑制其功能，而NPR1與SA的結合可通過構象變化破壞這種相互作用[9]。

誘導抗性響應在植物防御系統中起著重要的作用。NPR1是系統獲得性抗性(SAR)信號傳導途徑上的關鍵調控因子，是調節植物的抗病性的重要基因[10]。SAR的誘導物促進NPR1在Ser11/Ser15殘基上的磷酸化，然后促進其被cullin3為基礎的泛素連接酶補充。磷酸化的NPR1的轉換是完全誘導靶基因和SAR建立所必需的[11]。蠟狀芽孢桿菌AR156通過激活SAR來增強擬南芥的抗病能力，AR156誘導的SAR依賴于NPR1和SA信號通路[12]。水楊酸(SA)是植物免疫所需的一種防御激素。擬南芥的NPR1和NPR3/NPR4先前被證明可以結合SA，這3種蛋白都是SA受體。NPR1為轉錄共激活因子，而NPR3/NPR4被認為是促進NPR1降解的E3連接酶，其在SA誘導的防御基因轉錄調控中起著相反的作用[13]。NPR1基因參與了多種植物病菌的防御調控。香蕉NPR1家族成員MaNPR4 及MaNPR11的表達量隨著枯萎病菌的侵染時間延長而不斷增加[14]。在擬南芥中，超量表達AtNPR1基因可以增強植株對霜霉病菌(peronosporaparasitica)和丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)的抗性[15]。擬南芥AtNPR1基因在其他作物中也被證實可以增加植株抗病性，AtNPR1轉基因番茄不僅對番茄花葉病毒產生抗性，還對多種真菌性和細菌性病害表現出廣譜抗性[16]；AtNPR1轉基因胡蘿卜對核盤霉等病菌的抗性均明顯提高[17]；轉基因油菜表現出對丁香假單胞菌的抗性[18]。

除此之外，NPR1家族成員基因還參與了植物花和果實的發育。研究發現，2個NPR1-like基因BOP1和BOP2可以調控葉片和花的不對稱生長，其雙突變體出現多葉葉柄，花器官脫落，和被苞片包住的不對稱花[19]。油桐3個NPR1 家族基因在其雌花、雄花、兩性花中都顯著差異表達，且在雄花中表達量最高，推測油桐的3個NPR1 家族基因(VfNPR1/3/5)參與了花、果實發育和根系系統獲得性抗性信號途徑[20]。

南瓜是葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物[21]，具有易成活、營養價值高、產量大的特點，在世界各地均有種植[22]。中國南瓜(Cucurbitamoschata)是最具經濟價值的栽培種，可炒食、蒸食，果肉和種子中含有較高的多糖、β-胡蘿卜素、果膠等保健成分，在降血糖、降血脂、增強機體免疫等方面具有明顯作用[23]。因此，南瓜是一種具有較高的營養價值和藥用價值的蔬菜作物。前期課題組研究發現，CmNPR1在南瓜雌蕊敗育(表現為柱頭不同程度的缺失)材料中顯著下調表達，推測該基因對南瓜雌花發育具有重要作用。本研究對中國南瓜CmNPR1基因進行表達模式分析、基因克隆、生物信息學分析以及亞細胞定位，為進一步研究南瓜CmNPR1基因的生物學功能提供重要的參考依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

試驗所用植物材料為中國南瓜自交系‘3-1’，種植于新鄉市新東農場試驗田，采用常規方法進行栽培管理。在植株盛花期，取不同發育時期的雌花、雄花(縱徑0.5、1.0和2.0 cm)，選取葉片、幼嫩雌花、雄花(肉眼能區分花不同結構的最幼嫩時期，縱徑0.5～1.0 cm)解剖為雌花萼片、柱頭和子房，雄花萼片和雄蕊，取樣后立即放入液氮中冷凍，存儲于-80 ℃超低溫冰箱，用于后續檢測CmNPR1基因在花不同發育時期和花不同結構中的表達水平以及用于后續基因克隆實驗。

1.2 方 法

1.2.1 中國南瓜CmNPR1基因的克隆采用TaKaRa公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取南瓜雌花的總RNA，根據 TaKaRa公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行一鏈cDNA的合成。利用中國南瓜基因組數據庫(http：//cucurbitgenomics.org/organism/9)中同源基因的CDS序列，設計基因特異引物，并送往鄭州生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見表1。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的基因片段。然后，將其連接至pMD19-T載體，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，選取陽性單克隆菌液送鄭州生工生物工程有限公司測序。

1.2.2CmNPR1的生物信息學分析利用ExPASy ProParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白的理化性質，利用NCBI-CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白的保守結構域，利用Net Phos3.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白質磷酸化位點，利用NPS@：SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線工具預測二級結構，利用TMHMM Server V2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具進行跨膜結構域預測分析，利用SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在線工具預測信號肽，利用NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行基因序列同源性比對分析，利用DNAMAN 6.0軟件進行多序列比對分析，MEGA7.0構建系統進化樹。

1.2.3CmNPR1基因在植株不同結構中的表達采用TaKaRa公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒分別提取不同發育時期的雌花、雄花(縱徑0.5、1.0和2.0 cm)，葉片和花不同結構的總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒進行反轉錄。利用Primer Premier 5.0 軟件設計CmNPR1和內參β-Actin7基因的熒光定量引物，送鄭州生工生物技術有限公司進行合成，引物序列信息見表1。按照TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)熒光染料說明書進行實時熒光定量PCR，反應設置3個生物學重復，采用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量[24]。

表1 引物序列表

1.2.4 CmNPR1亞細胞位置的預測及定位首先利用在線軟件WoLF PSORT Prediction和Plant-mPLoc server對CmNPR1蛋白進行亞細胞定位預測分析。其次，構建GFP融合表達載體轉化擬南芥原生質體，確定CmNPR1蛋白表達的亞細胞位置。采用酶切連接法，將CmNPR1基因CDS片段(去掉終止密碼子)連入帶有GFP標簽的pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp載體，構建目的基因及GFP融合表達載體。挑取陽性融合載體的菌斑，搖菌，提取質粒DNA以備轉化。

制備擬南芥原生質體并轉化：選取25 ℃培養7～15 d的擬南芥愈傷組織，稱取5～10 g，磨碎。在組織中加入5～10 mL酶解液，以全部浸泡組織為宜。28 ℃，緩慢震蕩酶解5～6 h，用40 μm濾網過濾原生質體，然后用大離心管50×g離心10 min，去上清，用預冷W5溶液10 mL洗滌2次，每次50×g，離心5 min，可見管底渾濁沉淀。根據需要加入500 μL的MMG溶液懸浮。鏡檢：40倍鏡下，檢測原生質體。取200 μL原生質體懸液加入10 μL的質粒DNA(最好500 ng以上)，取與DNA和原生質體體積相等的PEG溶液，500 ng以上的純化質粒進行輕柔均勻混合。室溫靜置30 min。用1 mL W5稀釋原生質體。混合均勻終止反應。100×g離心5 min收集原生質體，去上清。加入1 mL W5溶液洗1～2次。最后，加入1 mL W5溶液，移至2 mL離心管中，28 ℃暗培養24～48 h，激光共聚焦顯微鏡觀察。其中，酶解液、W5溶液、MMG溶液參照Yoo等[25]進行配制。

2 結果與分析

2.1 南瓜CmNPR1基因的克隆

以南瓜雌花組織RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用CmNPR1基因特異引物CmNPR1-F和CmNPR1-R進行PCR擴增，擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1，可見唯一特異條帶，CmNPR1基因的CDS全長為1 442 bp。

M. DL2000； 1. CmNPR1圖1 CmNPR1的PCR擴增Fig.1 PCR product of CmNPR1

2.2 CmNPR1蛋白的理化性質及結構分析

經預測CmNPR1蛋白由480個氨基酸組成，分子式為C2254H3628N646O698S24，總原子數7 250，相對分子量為51.71 kD，等電點值為5.88，正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸)39個，負電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸)52個，脂肪氨基酸系數 95.50，平均親水性-0.047，不穩定系數49.65，說明該蛋白屬于不穩定性親水蛋白質。磷酸化是蛋白翻譯后最重要的修飾之一。NetPhos 3.1 server預測顯示，CmNPR1有76個磷酸化位點，其中絲氨酸49個，蘇氨酸21個，酪氨酸6個。利用NPS@:SOPMA預測發現，CmNPR1含有45.83%的α-螺旋，41.67%的無規則卷曲，7.92%的延伸鏈，4.58%的β-轉角，其中α-螺旋比例最高(圖2，A)。以已知蛋白結構DARPin-DARPin (PDB ID：5leb.1.A)為模板，采用SWISS MODEL建模，得到CmNPR1的三維結構，如圖2，B。SignalP 4.0 server和TMHMM分析顯示，CmNPR1蛋白無信號肽(圖3，A)和跨膜結構(圖3，B)。CmNPR1保守結構域預測結果顯示，CmNPR1氨基酸序列含有一個BTB-POZ(8-174位氨基酸)保守結構域，一個DUF3420(209-265位氨基酸)和一個錨蛋白重復序列Ank-2(272-353位氨基酸)特異位點(圖4)。

A. 二級結構預測(a. α-螺旋；b. β-轉角；c. 延伸鏈；d. 無規則卷曲)；B. 三級結構預測圖2 CmNPR1蛋白的二級結構和三級結構預測A. Prediction of the secondary structure (a. α-helix; b. β-turn; c. Extended strand; d. Random coil); B. Prediction of the tertiary structureFig.2 Prediction of the secondary and tertiary structures of CmNPR1

A. 信號肽預測；B. 跨膜結構預測圖3 CmNPR1蛋白的信號肽及跨膜結構預測A. Prediction of the signal peptide；B. Prediction of the transmembrane domainFig.3 Prediction of the signal peptide and transmembrane domain of CmNPR1

圖4 CmNPR1蛋白保守結構域預測Fig.4 Prediction of conserved domains of CmNPR1

2.3 CmNPR1蛋白的同源序列比對及進化分析

同源比對結果顯示，CmNPR1氨基酸序列與中國南瓜數據庫中基因XP_022932990.1的氨基酸序列一致性最高，達到96.67%，其次與美洲南瓜(Cucurbitapepo， XP_023554537.1)、印度南瓜(Cucurbitamaxima，XP_022967689.1)、冬瓜(Benincasahispida，XP_038883416.1)和黃瓜(Cucumissativus， XP_004150250.1)等葫蘆科作物的氨基酸序列一致性較高，分別為96.05%、95.63%、86.00%和86.44%(圖5)，與其他科作物相似性較低。系統進化樹分析結果與同源序列比對結果相似，中國南瓜CmNPR1與美洲南瓜NPR1親緣關系最近，其次親緣關系較近的為印度南瓜、冬瓜和黃瓜等同科作物，與黃木薯、橡膠樹、栗、中粒咖啡、香櫻桃咖啡和小果咖啡等其他科屬作物親緣關系較遠(圖6)。

圖5 CmNPR1蛋白與其他同源作物的氨基酸多序列比對分析Fig.5 Multiple sequence alignment analysis of CmNPR1 protein with homologous proteins of other plants

圖6 中國南瓜與其他作物NPR1蛋白的進化分析結果Fig.6 Phylogenetic analysis results of NPR1 in Cucurbita moschata and other plants

2.4 花發育不同時期及不同組織中CmNPR1的表達

利用熒光定量PCR技術，分析CmNPR1基因在南瓜雌花、雄花不同發育時期及花不同結構中的表達水平發現，CmNPR1基因在不同發育時期(縱徑0.5、1.0和 2.0 cm)的雌花和雄花中都有表達，其中在所取最幼嫩的雌花或雄花(0.5 cm時期)中表達量最高，該時期是花分化為花不同結構的關鍵時期，其表達量顯著高于1.0 cm和2.0 cm時期，說明隨著雌花和雄花的發育，該基因表達量逐漸降低(圖7，A)。對該基因在雌花和雄花不同結構中的表達分析發現，CmNPR1基因在雌花柱頭中的表達量最高，其次是雄花萼片、雌花萼片、雄蕊、葉片和子房。其中，柱頭中表達量是雄蕊中表達量的15倍，是葉片中表達量的47倍(圖7，B)；推測CmNPR1在南瓜花發育過程中具有重要作用。

不同小寫字母表示基因表達存在顯著差異(P<0.05)圖7 花發育不同時期及不同結構組織中CmNPR1的表達Different normal letters indicate significant difference in gene expression (P<0.05)Fig.7 Expression levels of CmNPR1 in different developmental stages and different structures of flowers and leaves

2.5 CmNPR1蛋白的亞細胞定位

在線軟件WoLF PSORT Prediction和Plant-mPLoc server亞細胞定位預測結果顯示CmNPR1蛋白位于葉綠體、細胞核、細胞質、質體的可能性較大。為了確定CmNPR1蛋白的亞細胞位置，構建了CmNPR1-GFP融合蛋白表達載體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示，CmNPR1-GFP融合蛋白在葉綠體未見明顯熒光，根據熒光所在位置判斷CmNPR1可能位于細胞質和細胞核(圖8)。

圖8 CmNPR1的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of CmNPR1

3 討 論

南瓜是世界廣泛種植的蔬菜作物之一[26]。研究表明NPR1基因在植物花和果實的發育[19-20]、晝夜節律穩態[27]以及抗凍性[28]等方面具有重要的調控作用，是SAR途徑中的關鍵調控因子，幾乎參與植物的整個生命周期[29]。本研究克隆南瓜CmNPR1基因，并對其進行生物信息學分析。研究發現， NPR1在各物種中具有高度保守性，含錨蛋白重復和BTB/POZ兩個蛋白互作結構域，這兩個結構域和蛋白與蛋白的相互作用緊密相關，對NPR1基因發揮其功能至關重要[2,6-9]。本研究中保守結構域預測發現，CmNPR1蛋白具有一個BTB/POZ保守結構域和一個錨蛋白重復序列(ANK)，本研究結果與陳觀水等[30]對甘薯等7種植物NPR1蛋白預測結果相似。同源序列比對和系統進化樹分析顯示，CmNPR1與同為葫蘆科作物的美洲南瓜、印度南瓜、冬瓜和黃瓜的NPR1一致性較高，說明該蛋白在進化過程中比較保守。了解蛋白的亞細胞定位有助于系統探究該基因的功能及其所在亞細胞位置和參與的代謝活動。NPR1蛋白的核轉運是其發揮調控作用的重要步驟，在沒有病原體攻擊的情況下，核NPR1蛋白不斷地被蛋白酶從細胞核中清除，抑制了其共激活活性[11]。本研究結果顯示CmNPR1蛋白位于細胞質和細胞核中，說明CmNPR1可能在細胞質和細胞核中行使功能，這與蘋果中MdNPR1蛋白定位于細胞質和細胞核的結果一致[31]。推測CmNPR1蛋白位于細胞質和細胞核兩個細胞位置可能和NPR1蛋白的核轉運有關。

多項研究發現NPR1家族成員可能參與了植物花和果實的發育[19-20]。在蘋果中，研究發現MdNPR7、MdNPR8均在花中表達量最高，且在莖，葉片及種子中表達量較低[31]。ZmNPR1在玉米各組織中均有表達，其中在雌穗中的表達量較高[32]。本課題組前期研究發現南瓜CmNPR1基因在南瓜雌蕊敗育材料中顯著下調表達[33]。為探究該基因在南瓜花發育中的作用，本研究分析了該基因在雌雄花不同發育時期、不同結構中的表達，結果顯示，該基因在最小花發育時期和雌蕊柱頭中的表達量最高。該研究結果與玉米[32]中ZmNPR1的研究結果具有一致性，推測CmNPR1基因可能對南瓜雌花尤其是雌蕊的發育具有重要作用。但該基因在南瓜花發育方面的功能還需要進一步進行功能分析。本研究中CmNPR1基因CDS的獲得和生物信息學分析及其在雌雄花不同發育時期、不同結構中的表達分析結果為深入研究該基因在南瓜花發育中的功能奠定了研究基礎。