妊娠期糖尿病孕婦血清miRNA-137表達與新生兒高膽紅素血癥的關系研究

董小菡，王亮，杜曉琴，于文亮，高迎春

(電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院·綿陽市中心醫院 婦產科，四川 綿陽 621000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是一種常見的妊娠期疾病，對母親和新生兒都會造成較高的并發癥風險，例如新生兒高膽紅素血癥[1]。修正的Pedersen 假說提出，母體的高糖環境易過度刺激胎兒胰腺 b 細胞，加速有氧代謝，增加胎兒的需氧量。但同時高糖環境又進一步減少母胎供氧量，從而造成胎兒相對缺氧的狀態[2-3]。這可能是導致新生兒發生高膽紅素血癥的重要生理機制之一。GDM的發病原因十分復雜，其中微小RNA(microRNA，miRNAs)在其中的作用不容忽視。Peng等[4]通過多項研究證實miR-137表達上調與GDM 誘導的內皮細胞功能障礙有關，而且下調 miR-137可以保護人類胚胎免受高糖誘導的氧化應激損傷；此外Chen等[5]通過小鼠實驗發現miR-137是結構性雄烷受體(constitutive androstane receptor,CAR)的抑制因子，因此是膽紅素清除率的關鍵性決定因素，并有望成為治療新生兒高膽紅素血癥的潛在分子靶點。我們在前期預實驗中發現miR-137不僅在GDM孕婦的胎盤組織中有異常表達，而且也穩定存在于孕婦的血液循環中。因此本研究旨在檢測GDM孕婦孕晚期血清 miR-137的表達，并探討其是否有望成為新生兒高膽紅素血癥潛在的預測指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年6月至2019年6月入院的73例GDM孕婦[年齡22～44歲，平均(31.62±5.03)歲]作為GDM組。納入標準：符合美國糖尿病協會最新制定的GDM診斷標準[6]，在孕24～28周完成口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)，空腹血糖≥5.1 mmol·L-1，1 h血糖≥10.0 mmol·L-1或2 h血糖≥8.5 mmol·L-1，被診斷為GDM；分娩孕周37～42周；自然受孕；單胎妊娠。排除標準：有溝通障礙或嚴重精神疾病者；有惡性腫瘤或嚴重心臟、肺、肝、腎及其他功能障礙者；妊娠前合并有糖尿病、高血壓或內分泌和代謝疾病史者；合并妊娠期高血壓、妊娠期甲減、子癇前期等其他妊娠期合并癥者。另外將新生兒宮內死亡或死胎者(缺少新生兒膽紅素或葡萄糖測量數據)、產檢或產后數據記錄缺失、由已知溶血因素造成的高膽紅素血癥(如猴同種免疫接種和ABO血型不相容)者排除在本研究外。另外選擇80例年齡、分娩孕周相匹配[年齡20～45歲，平均(30.49±5.33)歲]、妊娠期無GDM的孕婦作為對照組。本研究獲得我院倫理委員會批準。在參與者簽署同意書后獲取其孕24～28周血清樣本以及分娩后新鮮的胎盤組織樣本。根據新生兒經皮膽紅素監測和血清總膽紅素(serum total bilirubin，TSB)檢測結果，將GDM組分為高膽紅素血癥組(n=23)，其診斷符合中華醫學會兒科學分會新生兒學組相關診斷標準[7]：出生后7 d每日7：30進行經皮膽紅素監測，黃疸指數分別為出生24 h內>6，24 h 后足月兒>12.9、早產兒>15；在出生時、光療前測定血清總膽紅素水平，以出生 24 h 內 >102 μmol·L-1，24 h后足月兒>220.6 μmol·L-1、早產兒>255 μmol·L-1作為診斷新生兒高膽紅素血癥的診斷標準；不符合上述高膽紅素血癥診斷標準的新生兒納入非高膽紅素血癥組(n=50)。

1.2 孕婦血清和胎盤組織中miR- 137的測定

收集孕24～28周的肘部靜脈血液樣本，留取血清，保存在血液樣本庫中用作后續的生物學分析。另外在分娩時留取新鮮的胎盤組織樣本，置于液氮中24 h 后，更換到-80 ℃保存備用。在提取總RNA前，將血清樣本復溶。用Trizol試劑提取總RNA，提取后鑒定RNA濃度及純度，確保可以用于后續樣品檢測。再用miRNA first-strand cDNA試劑盒進行逆轉錄反應，使用miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒中的試劑、各0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA樣本配制15 μl PCR反應體系，用7300型熱循環儀進行反應，以小分子U6snRNA作為內參，2-ΔΔCt法計算miR-137相對表達量。試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。miR-137上游引物：5′-ATA GAG CGG CCA TTT GGA TT-3′，miR-137下游引物：5′-TCA AGG CCT TTC AGT CGT TC-3′。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 GDM組和對照組一般資料的比較

GDM組孕婦產前空腹血糖、新生兒出生身高以及Apgar 5 min評分<7分的新生兒比例顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；兩組孕婦年齡、體重指數、吸煙史、家族糖尿病史、收縮壓、舒張壓、胎兒分娩孕周、出生體重、出生頭圍、生產方式等差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 GDM組和對照組一般資料的比較

2.2 GDM組和對照組孕婦血清及胎盤組織miR- 137表達水平的比較

與對照組比較，GDM組血清、胎盤組織miR-137表達水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。Pearson相關分析顯示，GDM組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達呈正相關(r=0.623，P<0.05)，見圖1。

表2 GDM組和對照組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達水平的比較[M50(P25，P75)]

圖1 GDM組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達的相關性

2.3 GDM組孕婦血清miR- 137表達水平與新生兒高膽紅素血癥的關系

GDM組有23例新生兒發生高膽紅素血癥，高膽紅素血癥組孕婦血清miR-137表達水平高于非高膽紅素血癥組(2.12±0.79vs.1.13±0.31)，差異具有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關分析顯示，GDM組孕婦血清miR-137表達水平與新生兒血清膽紅素水平呈正相關(r=0.378，P<0.05)，見圖2。

圖2 GDM組孕婦血清miR-137表達水平與新生兒血清膽紅素水平的關系

2.4 新生兒發生高膽紅素血癥的影響因素

以新生兒是否發生高膽紅素血癥為因變量，進行單因素和多因素Logistic回歸分析，結果顯示，孕婦吸煙史、巨大兒、新生兒Apgar 5 min評分<7分、孕婦血清miR-137水平升高都是影響新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素，見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析新生兒發生高膽紅素血癥的影響因素

2.5 ROC曲線分析GDM孕婦血清miR- 137水平對新生兒高膽紅素血癥的預測價值

GDM孕婦血清miR-137水平預測新生兒高膽紅素血癥的曲線下面積(AUC)為0.904(0.825,0.983)，截斷值1.685，在該截斷值下靈敏度為0.739，特異度為0.947，見圖3。

圖3 GDM孕婦血清miR-137水平預測新生兒高膽紅素血癥的ROC曲線

3 討 論

GDM是一種常見的妊娠期疾病，對母親和新生兒都會造成較高的并發癥風險，例如肥胖、糖代謝紊亂、心血管疾病等[8]。新生兒高膽紅素血癥是GDM常見的并發癥之一[9]。在本研究中我們發現，診斷時孕婦血清miR-137水平升高、孕婦吸煙史、巨大兒以及新生兒出生時Apgar 5 min評分<7分都是GDM組發生新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素，尤其是檢測孕婦血清miR-137表達水平對于預測新生兒高膽紅素血癥發生風險有一定的指導意義。

目前關于篩查GDM孕婦發生新生兒高膽紅素血癥的危險因素研究相對較少。最近Thevarajah等[10]學者開展的一項單中心大樣本臨床調查研究結果顯示，診斷時較低的胎齡、多胎妊娠、子癇前期、巨大兒等都與高膽紅素血癥的發生獨立相關(P<0.05)。之前Langer[11]進行臨床研究發現，未經治療的GDM孕婦的新生兒低血糖和高膽紅素血癥發生風險較健康對照組孕婦增加2～4倍。根據修正的Pedersen 假說，在母體高血糖情況下，母胎葡萄糖濃度梯度落差較大，葡萄糖轉運蛋白1載體可將母體血清中過量的葡萄糖轉移至胎盤，通過過度刺激胎兒胰腺 b 細胞，進而產生高胰島素血癥的胎兒環境。而這種高胰島素血癥環境可刺激有氧代謝，增加胎兒需氧量。但是GDM孕婦血清糖化血紅蛋白升高和胎盤血流量減少則導致母胎供氧量減少，從而造成了胎兒相對缺氧的狀態。高膽紅素血癥被認為是這種相對缺氧狀態的反調節機制，它觸發了紅細胞分泌和促進紅細胞產生。

目前已經有越來越多的研究人員證實miR-137與機體代謝調控機制密切相關。Peng等[12]學者報道，重度GDM孕婦胎盤組織和高糖環境中的滋養層細胞系HTR-8/SVneo 細胞中 miR-137表達增加，同時FNDC5蛋白表達降低，而沉默HTR-8/SVneo 細胞中 miR-137表達后，FNDC5蛋白表達量則升高，說明滋養層細胞的增殖和遷移活性受到 miR-137表達水平升高的抑制。另外同一課題組隨后還證實上調人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中miR-137表達，可以增強U937和 THP-1細胞對HUVECs的趨化性和黏附性，而高糖環境則可上調miR-137的表達，進而抑制這種黏附性，同時可抑制 HUVECs血管生成和血管活性[13]。最終，作者推斷miR-137對高糖環境誘導的血管內皮功能障礙至關重要，可能參與了GDM的病理過程。在本研究中，我們分別檢測了GDM診斷時血清miR-137表達水平和新鮮胎盤組織中miR-137水平，兩者存在一定的相關性，且都較對照組孕婦樣本中的表達量升高，說明GDM孕婦血清樣本中升高的miR-137可能多數來自于胎盤組織細胞的分泌，但是這一點仍然需要進行更深入、更科學的基礎實驗結論支持。

高膽紅素血癥在新生兒中十分常見，主要表現為皮膚中大量膽紅素沉積，這是紅細胞破壞增加和膽紅素排泄減少共同導致的結果[14]。膽紅素通常是通過肝臟排泄到膽汁中。膽紅素清除功能缺失導致這種黃色素在血液或皮膚中大量積累。新生兒高膽紅素血癥可導致腦部某些區域(特別是基底核)的膽紅素積聚，從而對這些區域造成不可逆轉的損害，表現為各種神經功能缺陷、癲癇、聽力障礙和眼球運動[15-16]。因此，維持正常的膽紅素清除率是預防新生兒高膽紅素血癥和相關神經毒性的關鍵過程，更好地了解膽紅素清除率的機制至關重要。最近有研究證實膽紅素解毒酶和轉運蛋白的表達受到孤兒核受體(pregnane X receptor，PXR)和CAR的轉錄調控[17]。CAR是肝臟清除膽紅素的關鍵調節因子，因為它調節與藥物代謝、激素、能量和脂質平衡有關的基因的表達。但是CAR在新生小鼠和新生兒中的表達量極低，這在某些情況下可能產生明顯的病理后果，例如新生兒高膽紅素血癥和相關的神經毒性。而Chen等[5]則發現，miR-137在調節 CAR表達方面起到關鍵作用，敲低新生小鼠和成年小鼠肝組織/細胞中 miR-137表達，可以增加膽紅素清除率，這可能是因為miR-137表達的上調導致肝臟CAR表達水平降低，因此進而使新生兒膽紅素的清除率降低，因此靶向 miR-137可能是一種提高肝臟組織CAR表達和加速膽紅素清除的方法，以降低新生兒高膽紅素血癥發生風險。我們的研究結果與之相符。在本研究中，我們通過臨床樣本證實，在GDM組中，高膽紅素血癥亞組孕婦血清miR-137水平較非高膽紅素血癥亞組孕婦升高明顯，而且孕婦血清miR-137表達水平與新生兒血清膽紅素水平表現出顯著的正相關性，說明GDM孕婦高糖環境導致miR-137水平升高，而母體血清中高水平miR-137可能通過某種機制進一步影響了新生兒出生后膽紅素的清除率，增加了高膽紅素血癥的發生風險，但是這個結論尚需要擴大樣本量進一步證實其可靠性。

綜上所述，GDM孕婦血清miR-137表達水平明顯上調，而且這也是新生兒高膽紅素血癥發生的獨立危險因素，因此檢測GDM孕婦血清miR-137有望成為預測新生兒高膽紅素血癥發生的有效措施。