子癇前期患者胎盤血管生成情況的評估

朱莉娜，李萱，于震，楊媛媛

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院 婦產科，安徽 合肥 230000；2.國家衛生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室，安徽 合肥 230000；3.生殖健康與遺傳安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230000)

子癇前期是指妊娠20周以后新發高血壓疾病，其典型表現為血壓升高[收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg]，伴有蛋白尿[≥300 mg·(24 h)-1]或心、肺、肝、腎等重要器官，或血液、消化、神經系統的異常改變，主要表現為母體器官內皮功能損傷樣表現，可影響胎兒宮內正常發育[1]。子癇前期是圍生期孕產婦和胎兒死亡的主要原因，并且對母體和胎兒的健康有遠期影響，會增加母體后期發生心血管疾病的風險，其子代發生慢性非傳染性疾病的風險也大大提高[2]，但子癇前期的發病機制尚不清楚，不能用單一的機理來解釋子癇前期的發病，因此探明其發病機制對于預防子癇前期的發生及治療均有顯著的臨床意義。

子癇前期是胎盤源性疾病，其進展可分為兩個階段：(1)妊娠早期的胎盤形成異常；(2)妊娠中晚期的母體綜合征，由于早期胎盤發育異常導致胎盤持續缺血或缺氧，進而造成胎盤合體滋養細胞分泌抗血管生成因子增多(主要是sFlt1)，從而引起母體器官內皮損傷樣表現[1]。子癇前期主要胎盤病理表現為胎盤形成異常，造成胎盤功能不全[3]。胎盤血管生成是胎盤形成的關鍵，本研究的主要目標是評估子癇前期患者胎盤血管生成狀況，為子癇前期的病因學研究提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月至12月在安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科分娩的40例子癇前期患者作為病例組，選取同時期分娩的40例血壓正常、無其他妊娠并發癥的產婦作為對照組。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，所有患者及其家屬均簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：(1)患者均符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》中關于子癇前期的相關診斷標準[4]，具體如下：妊娠20周后孕婦出現收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，伴有下列任意1項：尿蛋白定量≥0.3 g·(24 h)-1，或尿蛋白/肌酐值≥0.3，或隨機尿蛋白陽性(無條件進行蛋白定量時的檢查方法)；無蛋白尿但伴有以下任何1種器官或系統受累：心、肺、肝、腎等重要器官，或血液、消化、神經系統的異常改變，胎盤-胎兒受到累及等；(2)對照組孕婦無任何妊娠合并癥，無蛋白尿，且胎兒發育正常；(3)所有孕婦均為自然受孕。

排除標準：(1)有高血壓、糖尿病、心臟病及腎病病史的患者；(2)有結核或肝炎等急慢性傳染病的患者；(3)有免疫性疾病的患者；(4)出現胎盤早剝、胎盤前置或胎膜早破等妊娠并發癥的患者。

1.3 方法

1.3.1 胎盤的收集 胎盤娩出后采用打孔法取一塊貫穿胎盤全層的組織，用4%多聚甲醛固定。每個胎盤打孔的位置取臍帶附著點中外1/3處，拍照留存。固定24 h后制作胎盤蠟塊，縱切面制作胎盤石蠟切片(3 μm)，采用免疫組化法評估胎盤血管生成情況。

1.3.2 免疫組化染色 以CD34為內皮標志物，采用免疫組化法評估胎盤血管生成情況，具體步驟如下：將胎盤石蠟切片(3 μm)放入二甲苯中脫蠟，然后經梯度乙醇水化，PBS漂洗后用3‰的Triton X 100進行通透，采用微波加熱修復法在枸櫞酸鹽溶液中對抗原進行修復，然后用3%過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶，隨后用山羊血清進行封閉；甩去血清后每張玻片加入50 μl的CD34抗體(1∶500)，濕盒中室溫放置1 h，將濕盒放入4 ℃冰箱過夜；第2天將濕盒取出，37 ℃孵育45 min，然后回收抗體，PBS漂洗后加入SP試劑3，37 ℃反應30 min；PBS漂洗后加入SP試劑4，37 ℃反應30 min，PBS漂洗后進行DAB顯色，視野中出現特應性橘黃染色時終止反應；隨后進行蘇木素復染，PBS返藍后經梯度乙醇和二甲苯脫水，中性樹脂封片。干片后進行圖像采集，用Image J軟件對圖片進行分析。

1.3.3 胎盤血管生成水平評價 每個胎盤切片在400倍視野下采集8～10個非連續視野，計數每個視野下的CD34+血管數量，取平均數作為胎盤血管生成水平的評價指標；按照每視野下CD34+血管數將胎盤血管生成情況分為3個等級，平均每視野下CD34+血管數目≥120個評定為高水平，≥90個且<120個評定為中等水平，<90個被評定為低水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料和出生結局的比較

兩組年齡、體重指數(BMI)和孕期增重差異無統計學意義(P>0.05)，病例組患者血壓(收縮壓和舒張壓)明顯高于對照組(P<0.01)。與對照組相比，病例組患者分娩孕周明顯縮短，胎盤重也明顯降低，胎兒出生體重、身長、頭圍明顯降低或縮短，即刻及1、5 min Apgar評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料和出生結局的比較

2.2 兩組胎盤血管生成情況的比較

病例組患者胎盤平均每視野下CD34+血管數明顯減少(圖1A、B)，表明子癇前期患者胎盤血管生成障礙。按照分級標準對兩組胎盤血管生成情況進行等級評價，結果如圖1C所示，對照組胎盤血管生成等級主要集中在高水平和中水平，病例組胎盤血管生成等級主要集中在低水平和中水平，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 不同胎盤血管生成等級患者的一般資料和出生結局的比較

與高水平組和中水平組相比，低水平組患者血壓(收縮壓和舒張壓)升高，孕周縮短，胎兒出生體重、身長、頭圍和胎盤重降低或縮短，即刻及1、5 min Apgar評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

A.以CD34為內皮標志物，采用免疫組化法對兩組胎盤血管生成情況進行比較，圖中選取具有代表性的視野；B.兩組每個視野下血管數量的比較；C.兩組胎盤血管生成等級比較

表2 不同胎盤血管生成等級患者的一般資料和出生結局的比較

3 討 論

子癇前期是產科臨床常見妊娠并發癥，主要癥狀為母體內皮損傷樣表現，如高血壓、蛋白尿等。子癇前期是圍生期孕產婦和新生兒死亡的主要原因，僅次于產后出血，排在第2位，嚴重危害婦女健康。子癇前期患者的主要表現為母體血壓升高。本研究子癇前期的診斷參照2020年最新妊娠期高血壓指南，子癇前期的診斷更加明確、嚴格。子癇前期患者遠期的健康也會受到影響，其在生命后期罹患高血壓、冠心病等心血管疾病的風險更高，已有很多研究證實，子癇前期患者在生命后期發生心血管事件的風險更高[5]。同時，子癇前期還是胎兒早產的主要原因，由于病因不明確，子癇前期尚缺乏有效的治療手段，目前唯一有效的治療方法是終止妊娠，娩出胎盤[6]。娩出胎盤后孕婦血壓即可下降，在24 h內絕大多數孕婦血壓將會恢復至正常水平。我們的研究結果也表明，子癇前期患者的孕周顯著短于對照人群，從而會導致胎兒出生體重、身長以及頭圍顯著低于對照組。

先前的研究表明，子癇前期是胎盤源性疾病，其發生可分為兩個階段，首先是妊娠早期的胎盤形成異常，隨后是母體癥狀的出現。子癇前期的發生是胎盤依賴性的，其胎盤病理表現包括螺旋動脈重構不足、胎盤植入過淺。妊娠早期胎盤形成過程主要依賴于胎盤血管生成[7]。血管生成是指從已有的血管分支形成新血管的過程，在母胎界面形成中發揮著重要作用。胎盤血管形成障礙會導致不良妊娠結局的發生，如胎兒宮內生長受限[8]。我們先前的研究表明，孕期鄰苯二甲酸酯暴露會導致胎盤血管生成減少，導致胎兒宮內生長受限，同時也發現與適于胎齡兒相比，小于胎齡兒胎盤血管生成明顯減少[9]。但目前尚沒有研究對子癇前期患者胎盤血管生成情況進行分析。本研究結果表明，子癇前期患者胎盤血管生成減少，表現為每視野下CD34+血管數量減少，對胎盤血管生成水平進行等級分析發現，子癇前期患者胎盤血管生成主要集中在低水平。

雖然我們發現子癇前期患者胎盤血管生成減少，但是本研究中我們并沒有對胎盤血管生成減少的原因進行探索。子癇前期患者胎盤血管生成減少的原因復雜，越來越多的研究關注到孕期環境暴露與不良妊娠結局之間的關聯，研究表明孕期鎘暴露可導致子癇前期發生風險升高[10]，并且已有動物模型證實，孕期給予大鼠氯化鎘處理，可導致大鼠子癇前期樣癥狀[11]。胎盤是鎘暴露作用的直接靶點[12]，孕期鎘暴露可導致胎盤血管生成減少[13]。子癇前期患者胎盤血管生成減少可能與孕期鎘暴露有關，但潛在的機制需要進一步的研究和探討。