復墾土壤細菌群落結構及其與土壤肥力的關系

劉 俊，張世文,2※，宋桂芳，王 陽，祝亞飛，魯勝軍，蘭 淼，夏沙沙

復墾土壤細菌群落結構及其與土壤肥力的關系

劉 俊1，張世文1,2※，宋桂芳1，王 陽1，祝亞飛1，魯勝軍1，蘭 淼1，夏沙沙1

（1. 安徽理工大學地球與環境學院，淮南 232001；2. 安徽省高潛水位礦區水土資源綜合利用與生態保護工程實驗室，淮南 232001）

為了解兩淮煤礦區復墾狀況及其對土壤微生物的影響機制，合理人工干預，快速有效提高復墾土壤生產力，本研究以煤矸石充填復墾土壤為研究對象，通過野外調查與采樣分析，采用Illumina MiSeq 高通量測序分析土壤細菌特定基因片段V4 區域，基于非度量多維尺度分析、冗余分析、方差分析、肥力指數、回歸模型方法，對矸石充填土壤不同復墾方向的土壤細菌優勢群落和生物多樣性進行了探索，明晰土壤細菌群落及其與土壤肥力的響應作用。研究結果表明：細菌群落組成上，不同復墾方向對細菌優勢群落分布并無顯著性影響，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門菌群為主要優勢菌群。土壤微生物多樣性層面上，表層土壤微生物有較高的豐富度和多樣性，均勻度并無顯著性差異。微生物多樣性在不同復墾方向不存在顯著性差異，Shannon_Wiener指數介于6.19～6.85之間，Chao1指數為3131.97～4938.37，Pielou指數介于0.79～0.84之間，表中層同深層土壤的細菌群落結構具有差異性。TN、SOM、AP和AK是影響土壤細菌群落的主要肥力因子，土壤肥力質量指數與奇古菌門相對豐度呈顯著正相關（＜0.01），同鏈霉菌屬呈顯著負相關（＜0.05），在一定程度上可將二者的相對豐度作為評價復墾土壤肥力狀況的重要生物指標。研究成果可為兩淮礦區矸石充填復墾土壤在微生物層面提高肥力質量提供理論支持。

復墾；細菌；高通量測序；群落結構；土壤肥力

0 引 言

兩淮礦區作為中東部重要的能源基地，礦產資源開采導致了一系列的礦區土地生態環境問題，對此需要采取人工和生態措施等合理有效措施對礦區采煤塌陷破壞耕地進行修復，優化礦區生態環境。煤矸石充填復墾不僅能恢復采煤沉陷區的土地資源，而且能處理消化煤矸石，經濟環境效益顯著[1]。然而由于充填導致的復墾土壤與原始土壤的理化性質差別較大，使得土壤微生物的生長環境發生巨大的變化，導致土壤肥力發生明顯變化。土壤微生物作為土壤環境中最重要的組成部分，容易受環境影響[2]，當土壤環境發生變化時，土壤微生物能迅速做出反應，其群落結構發生變化，對土壤肥力變化具有重要指示作用。土壤細菌參與土壤養分的轉化[3]，在土壤微生物中占絕對優勢，對礦區生態復墾起到重要的作 用[4]。因此，土壤微生物可以用來衡量復墾土壤肥力質量，監測礦區土壤環境變化[5-6]。

目前，高通量測序技術因其能夠充分揭示微生物群落優勢菌群的分布情況，同時還能發現土壤微生物的群落結構特征及多樣性變化[7]，而在土壤微生物的研究領域中應用廣泛。王繼玥等[8]利用宏基因組學測序技術，測定了不同Pb濃度梯度下三葉草根際土壤中的細菌群落結構，發現1菌群是具有Pb污染抗性的優勢菌群。侯湖平等[9]采用 Illumina PE250 測序方法測定微生物群落組分，對比分析發現復墾土壤在各個分類水平的細菌種類數量減少，群落多樣性降低。王瑾等[10]利用454高通量測序技術，發現土壤細菌群落對不同復墾區域的采煤沉陷復墾土壤響應大同小異。Li等[11]研究了黃土高原西北部露天煤礦復墾土壤微生物相對豐度和多樣性，揭示了細菌等微生物群落演替對于不同復墾方案的響應敏感程度存在顯著差異。由此可見，土壤細菌群落在衡量土壤質量方面發揮著重要作用。

綜上，當前研究主要集中于土壤細菌及其群落結構等方面，土壤肥力指數作為各項土壤理化性質的綜合反映，與土壤微生物的響應關系研究較少。因此，本文以兩淮礦區采煤沉陷復墾土壤為研究對象，結合Illumina Nova 6000 平臺對構建的擴增子文庫進行PE250測序，分析土壤細菌特定基因片段V4區域，研究矸石充填復墾土壤在不同復墾方向的細菌群落結構及生物多樣性，并基于土壤肥力評價結果，探討土壤細菌群落同土壤肥力指數之間的關系，旨在探尋細菌群落對土壤肥力的響應作用。研究成果可為兩淮礦區在微生物層面提高復墾土壤生產力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區域位于安徽省兩淮采煤塌陷區，屬暖溫帶半濕潤季風氣候，是中國重要的煤炭生產基地之一。煤炭開采帶來的地面沉降、地表裂縫及熔巖塌陷等現象，對土壤造成了嚴重損傷。基于兩淮礦區實際情況，采取了煤矸石充填復墾模式，以此緩解塌陷帶來的各種影響。復墾工藝為：首先用推土機將原地表土推至工作面，然后填充矸石，用振動碾壓機進行振動碾壓，再用推土機將堆放的地表土覆蓋矸石[12]。煤矸石充填至標高 +13.40 m，再覆土60 cm左右，農田平均標高為+14.00 m，復墾年限為15a、復墾面積 23 hm2，土壤pH整體呈弱堿性。覆土層土壤質地為砂質黏壤土，煤矸石質地為砂壤土，顆粒間差異較大，化學成分以SiO2為主，土壤孔隙較小。在分層回填過程中，為保證回填土地的保水性能，將粒徑大的矸石回填到塌陷區的底部，然后依次回填小粒徑矸石，在將矸石倒入塌陷坑的同時，人工將黃土鏟入矸石中混合。復墾區主要分為三種復墾方向：一是復墾為草地，主要種植大濱菊草本植物；二是復墾為耕地，常年采取小麥-玉米輪作模式；三是復墾為林地，主要種植池杉等杉科、落羽杉屬植物。本研究在復墾區 內主要選取草地、耕地和林地3種不同復墾方向土壤 進行分析，分別記為C、G和L，具體情況和布置見 圖1。

圖1 研究區試驗布置與樣點圖

1.2 樣品采集

土樣采集時間為 2019 年6月，采取五點采樣法，進行3次重復采樣，按照S型選取5個采樣點。用土鉆按照表層（0～20 cm）、中層（20～40 cm）、深層（40～60 cm）進行土壤分層取樣（分別標為1、2、3），取5點混合由此形成1個樣品。去除石頭、植物殘留物、動物和其他雜物后將其分為兩份，一部分土壤樣品在-80℃的環境中冷凍保存，用于高通量測序；另一部分則置于陰涼、通風且無陽光直射的房間內，將樣品倒在鋪墊有牛皮紙的風干盤中，攤成2～3 cm的薄層，并將樣品標簽粘貼在牛皮紙上。當土壤樣品半干時，用磨土棍將大土塊碾碎，以免完全風干后結成硬塊，難以磨細。樣品風干后，按四分法棄去多余部分，保留300 g左右。依據肥力指標測定需求，分別過2、0.85、0.15 mm篩子，將過完篩子的土樣分別裝袋保存，貼標簽、編號并盡快進行測定。

1.3 土壤肥力指標測定

參照《土壤農化分析》[13]，土壤有機質（Soil Organic Matter，SOM）含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定；對于全氮（Tonal Nitrogen，TN）含量，將土壤經過濃硫酸-高氯酸消解后，采用凱氏定氮法測定；對于速效磷（Available Phosphorus，AP）含量，采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；對于速效鉀（Available Kalium，AK）含量，采用1 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法測定；土壤pH值用BPH-252pH計測得，土壤提取液采用 1:2.5土水比浸提。

1.4 土壤細菌16S rRNA 基因序列分析

1.4.1 DNA提取及PCR 擴增

采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取、純化種子總DNA，利用Thermo NanoDrop One 檢測DNA的純度和濃度，試驗從DNA提取到測序分析均設置3個重復[14]。PCR擴增及產物電泳檢測以基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶barcod的特異引物及TaKaRa Premix Taq?Version 2.0（TaKaRa Biotechnology Co., Dalian, China）進行PCR 擴增。PCR反應體系為2x Premix Taq 25L、Primer-F（10 μM）1L、Primer-R（10 μM）1L、模板DNA50ng，總體積50L[15]。PCR產物檢測合格后，采用引物序列為5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，擴增樣品中原核生物V4 可變區構建高通量測序文庫，使用Illumina Nova 6000平臺對構建的擴增子文庫進行PE250測序（16S rRNA測序委托廣州美格基因科技有限公司完成）。

1.4.2 OTU聚類與物種注釋

在序列相似性97%的參數水平上對每個質量閾下序列參數進行一個相似性參數聚類，以用于測序所有一個質量閾下序列的參數的均值并過濾OTU（Operational Taxonomic Units），同時去除嵌合體[16]。選取OTU的代表性序列，利用usearch-sintax對每個OTU的代表序列進行物種分類，設定置信度閾值為0.8，與SILVA(16S)數據庫進行比對獲得物種注釋信息，獲得分類學信息并分別在界、門、綱、目、科、屬、種水平統計群落組成。

1.5 數據處理

所得數據采用Excel 2019進行記錄。基于門、綱分類水平的物種注釋和豐度信息，繪制物種豐度堆疊圖。使用R vegan 軟件包計算Alpha多樣性指數，包括Shannon_Wiener指數、Chao1指數、Pielou指數及Coverage指數。Alpha多樣性、土壤肥力指標差異采用單因素方差分析（ANOVA），在＜0.05時觀察到顯著性，多重比較采用Dunnett’s-t檢驗。利用Beta多樣性分析細菌群落組成的差異，采用R vegan 軟件包做基于bray-curtis差異矩陣的非度量多維尺度分析（Non-metric Multidimensional scaling，NMDS）以比較和可視化土壤樣本之間的相似性。基于冗余分析（RedunDancy Analysis, RDA）探討細菌群落與土壤肥力因子之間的關系。利用皮爾森相關分析（Pearson correlation）和線性回歸模型（Linear Regression Model，LRM）揭示土壤細菌群落同土壤肥力指數之間的響應作用。本文統計學檢驗使用SPSS 24.0軟件，繪圖使用軟件Origin Pro2021、R×64 3.6.3。

2 結果與分析

2.1 不同復墾方向土壤細菌多樣性分析

2.1.1 細菌群落組成

為明確矸石充填復墾土壤的細菌優勢群落信息，對不同復墾方向的土壤細菌群落在門、綱分類水平獲得的OTU 序列進行劃分，相對豐度＞0.01%的主要細菌種類有10種，相對豐度＜0.01%的細菌種類合并為其他（others），結果如圖2所示。門分類水平上，不同復墾方向土壤細菌相對豐度前5的優勢群落為變形菌()（37.72%）、酸桿菌（）（12.66%）、放線菌（）(12.63%)、綠彎菌（）（8.26%）、擬桿菌（）（7.41%），共占細菌總數的78.68%。C2相比C1、G2，變形菌的相對豐度分別增加5.32%、3.67%（＜0.05）；L3較G3變形菌相對豐度增加8.06%（＜0.05）；與L2相比，L1酸桿菌相對豐度增加2.49%（＜0.05）；G2較G1放線菌相對豐度增加0.31%（＜0.05）；L3相比L1綠彎菌相對豐度增加61.10%（＜0.05）。

綱分類水平上（圖2 b）相對豐度前5的細菌優勢群落自高向低依次為-變形桿菌()（29.30%）、-變形桿菌（）（13.07%）、擬桿菌（）（9.76%）、放線菌（）（9.23%）、-變形桿菌（）（8.51%）。G1較L1-變形桿菌的相對豐度增加27.90%（＜0.05）；與C3相比，C2擬桿菌的相對豐度增加71.77%（＜0.05）；C2較C1放線菌的相對豐度增加10.95%（＜0.05）。

注：C1，草地0～20 cm；C2，草地20～40 cm；C3，草地40～60 cm；G1，耕地0～20 cm；G2，耕地20～40 cm；G3，耕地40～60 cm；L1，林地0～20 cm；L2，林地20～40 cm；L3，林地40～60 cm。下同。

2.1.2 細菌Alpha多樣性

為明晰矸石充填復墾土壤細菌群落豐富度、均勻度的差異性，本文基于單因素方差分析，以Chao1指數、Shannon_Wiener指數、Pielou指數及Coverage指數衡量煤矸石充填土壤細菌Alpha多樣性的變化（表1）。

結果顯示，0～20 cm和20～40 cm土層，草地Chao1指數和Shannon_Wiener指數大于耕地和林地。隨著土層深度的逐漸增加，細菌豐富度逐漸降低，這可能是由于深層土壤缺乏通透性，其土壤溫度、氧氣、活性碳庫等狀況變差[17]。在不同土層深度下，多樣性指數波動并不大，耕地深層土壤與表中層存在顯著性差異（＜0.05）。表層土壤Pielou指數在不同復墾方向上存在差異性，耕地顯著大于林地（＜0.05），林草地表層土壤均勻度低于深層，這可能是因為植物根系分泌物中富含有機酸、維生素、氨基酸等多種物質，影響著土壤細菌群落組成，而不同植物的根系分泌物不同，從而有選擇地影響著土壤細菌群落[18]。由反映測序深度的Coverage 指數知，本次測序各樣本均在97%以上，樣品檢測到的樣本覆蓋率高，說明可以直接檢驗到土壤環境細菌中的絕大多數土壤細菌物種，充分反映了樣品中各種細菌的真實情況。

表1 不同復墾方向土壤細菌Alpha多樣性比較

注：不同小寫字母表示同一土層中不同復墾方向之間差異顯著（＜0.05），不同大寫字母表示同一復墾方向不同土層間差異顯著（＜0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences between different reclamation directions in the same soil layer at the<0.05 level, different capital letters indicate significant differences between different soil layers in the same reclamation direction at the<0.05 level.

2.1.3 細菌Beta多樣性

為了更加清晰地反映不同復墾方向細菌群落結構存在的差異性，本研究基于bray_curis距離矩陣對OTU分類水平的細菌群落進行非度量多維尺度分析（NMDS），通過二維排序圖描述細菌群落組成之間的差異性（圖3）。每個點代表1個土壤樣本，不同顏色的點屬于不同組，兩點之間的空間距離越接近，表明兩樣本之間的細菌群落組成相似度越高，差異越小。圖3顯示，NMDS分析圖的應力函數值stress=0.10（＜0.2），認為NMDS二維空間的擬合結果可以準確反映不同復墾方向細菌群落的真實情況。對比同一方向不同土壤樣本細菌群落組成之間差異性小，對比不同方向的土壤細菌樣本，細菌群落之間距離較近，相似性大。C1、C2之間差異性小，相似性大，都與C3 具有差異性。G1、G2和G3之間，細菌群落組成相似程度較近，各樣本間差異性小，相似性大，同G3 具有差異性。L1、L2 和L3 之間，L1與L2差異性小，相似性大，同L3具有差異性。由以上可知，各土壤樣本在空間上距離較近，表層和中層的土壤細菌群落相似性大，差異性小，表層、中層同深層土壤的細菌群落具有差異性，這是由于表中層土壤與深層土壤水分、通氣性、溫度、養分等土壤細菌生存狀況不同，導致土壤細菌組成產生差異[19]。

圖3 基于bray_curis距離的細菌群落非度量多維尺度（NMDS）分析圖

2.2 不同復墾方向土壤肥力特征分析

2.2.1 土壤肥力指標差異性

綜合考慮土壤肥力的影響因素并結合試驗條件，以方差分析為手段，選取全氮、速效磷、速效鉀、有機質、pH對土壤肥力影響較大的肥力指標，明晰不同復墾方向土壤肥力特征，結果見表2。

表2 不同復墾方向土壤肥力指標統計特征值

注：同列數據后不同小寫字母表示<0.05 水平存在顯著性差異。

Note: The different letters indicates significant differences at the level of<0.05.

表層（0～20 cm）土壤，速效鉀在3種土壤復墾方向上變化波動不大，在306.00～325.67 mg/kg之間，并不存在顯著性差異；耕地全氮、有機質含量為1.48 g/kg、20.80 g/kg，分別是林地的1.35倍、1.53倍；草地速效磷含量最高，相比于林地，增加了1.94倍；草地顯著高于耕地、林地（＜0.05）；中層（20～40 cm）土壤，除速效磷外，不同復墾方向波動不大，并無顯著性差異；耕地速效磷含量最高，為8.00 mg/kg，是草地（5.30 mg/kg）的1.51倍，各樣地之間存在顯著性差異（＜0.05）。深層（40～60 cm）土壤，速效磷、有機質在3種復墾方向上，均呈現出不同類型的差異性，草地含量最高，分別為8.07 mg /kg、10.41 g/kg，高于林地1.31倍，耕地0.39倍，各樣地之間存在顯著性差異（＜0.05）。樣本pH值介于7.78～8.30之間，呈弱堿性，在不同復墾方向上并不存在顯著性差異。

對照全國土壤養分含量分級標準表[20]，研究區內土壤全氮含量介于0.78～1.47 g/kg之間，屬中等水平；速效磷含量介于3.50～14.40 mg/kg之間，大部分處于中等水平，林地深層土壤較為缺乏；速效鉀含量介于217～325.67 mg/kg之間，處于極高水平，含量較為豐富；有機質含量介于7.49～20.80 g/kg之間，大部分處于中等水平，耕地深層土壤較為缺乏。

2.2.2 土壤肥力指數

依據全國土壤養分含量分級標準表，選取全氮、速效磷、速效鉀、有機質作為肥力評價因子，進行隸屬度計算，消除量綱影響。查閱相關文獻[21]，選擇S 型隸屬度函數，同時參照《全國第二次土壤普查技術規程》，確定各指標隸屬度函數轉折點。采用變異系數法確定指標權重，根據各指標的隸屬度和權重，然后將兩者相乘并進行累加，即可得到復墾土壤肥力指數（Integrated Fertility Index，IFI），指數越大，表明區域土壤肥力越好。圖4為不同復墾方向土壤肥力指數。

圖4 不同復墾方向土壤肥力指數比較分析

圖4顯示，土壤肥力指數在不同復墾方向間并不存在顯著性差異。耕地IFI值最高，為0.45，高于草地和林地，變異系數最低，為18.22%，說明在三種復墾方向中，耕地不同土層深度的土壤肥力相差較小，接近于平均水平，表明該地區最佳復墾方向為耕地。草地局部區域IFI值最大，標準差最高，變異系數偏高，說明草地不同土層深度土壤肥力存在差異性，偏差較大。林地IFI值最低，變異系數卻為最高，說明林地土壤肥力最差，不同土層深度土壤肥力不均衡且偏低。

2.3 微生物多樣性對土壤肥力響應作用

本研究將煤矸石充填復墾土壤細菌相對豐度視為衡量微生物多樣性的測度指標，土壤肥力指數作為土壤肥力的評價指標，以此探討微生物多樣性對土壤肥力的響應作用。以土壤細菌相對豐度為響應變量，肥力因子為解釋變量，基于RDA開展復墾土壤細菌相對豐度與肥力因子的冗余分析。

圖5顯示，第一排序軸（RDA1）解釋了75.23%，第二排序軸（RDA2）解釋了12.66%。前2個軸土壤肥力因子解釋量達到了85%以上，說明軸1和軸2能解釋絕大部分土壤細菌的分布情況。圖中肥力因子各自所在射線與各土壤細菌群落相對豐度所在射線之間的夾角大小及其射線長度說明了土壤肥力因子對煤矸石充填復墾土壤細菌的影響程度：全氮（TN）與酸桿菌門（）、鞘脂單胞菌屬（）、呈顯著正相關（＜0.05），與綠彎菌門（）、固氮弓菌屬（）呈極顯著負相關（＜0.01）；速效磷(AP)與變形菌門（）、固氮弓菌屬、呈顯著負相關（＜0.05）；速效鉀（AK）與酸桿菌門（）、芽單胞菌門（）、呈極顯著負相關（＜0.01），與綠彎菌門、固氮弓菌屬極顯著負相關（＜0.01），與假單胞菌屬（）、、鏈霉菌屬（）顯著負相關（＜0.05）；土壤有機質(SOM)與酸桿菌門呈顯著正相關（＜0.05），與擬桿菌門（）、芽單胞菌門（）呈極顯著正相關（＜0.01），與綠彎菌門、固氮弓菌屬、鏈霉菌屬極顯著負相關（＜0.01）；土壤肥力指數（IFI）作為土壤肥力指標的綜合反映，與奇古菌門（）呈極顯著正相關（＜0.01），與鏈霉菌屬呈顯著負相關（＜0.05），說明在土壤肥力的影響因子中，細菌相對豐度較低的菌群對土壤也有不可忽視的作用[22]。

圖5 細菌群落與肥力因子RDA分析

基于冗余分析結果，為進一步優選出對土壤肥力指數具有響應作用的細菌，利用皮爾森相關分析和線性回歸模型探究主要細菌群落同土壤肥力指數之間的關系，結果見圖6。

圖6顯示，土壤肥力指數與奇古菌門相對豐度極顯著正相關（＜0.001，2=0.55，圖6a），與鏈霉菌屬相對豐度顯著負相關（=0.009，2=0.24，圖6b），表明奇古菌、鏈霉菌可以在一定程度上影響研究區復墾土壤肥力。馬靜等[23]研究發現，奇古菌可以參與硝化作用，氧化銨應對采礦沉陷導致的土壤養分貧瘠環境，改善采煤沉陷區的土壤肥力。鏈霉菌屬在微生物學上從屬于放線菌門，何文[24]認為放線菌抗逆性強，產生的抗生素及次生代謝產物，可以大量地進行人工繁殖，噴施或者施入土壤，調節土壤微環境，并能長時間定殖，部分菌株還具有一定的促生作用等。這表明奇古菌、鏈霉菌可以改善土壤環境，增強土壤肥力。圖6c、圖6d表明變形菌門、放線菌門等主要優勢菌群同土壤肥力指數的相關性并不顯著，解釋量為2≤0.1，＞0.05，這可能與土壤環境的復雜性及矸石充填覆土的特殊性等多方面因素相關[25]。

圖6 土壤細菌相對豐度與土壤肥力指數的線性回歸模型

綜合考慮值、2因素，矸石充填不同復墾方向土壤肥力指數與奇古菌、鏈霉菌的相對豐度具有強相關性，對土壤肥力指數有一定響應作用，在研究區可通過二者的相對豐度變化表征土壤肥力的優劣，可采取措施合理人工干預，改善復墾土壤肥力，提高土地生產力。

3 討 論

細菌是土壤微生物中占比最大，數量最多的種群[26]，對于森林、草原及農田等的生態系統環境具有重要的影響，是一種驅動和保護地球的生物化學過程的關鍵因 素[27]。本研究發現，不同復墾方向中相對豐度最高的菌種保持一致，優勢門類群（相對豐度前3）均為變形菌門（32.42%～42.97%）、酸桿菌門（10.47%～15.87%）、放線菌門（8.90%～18.28%），與孫瑞波等[28]和Liu等[29]在不同類型土壤中得到的細菌優勢菌群相似。已有研究發現，變形菌以善于利用各種有機物的獨特性而在營養豐富的環境中更易受到青睞[30]，變形菌的相對豐度最高，這與一些研究所報道的結果相一致[31-32]，證實了矸石充填復墾土壤細菌群落結構中變形菌呈絕對優勢，僅是在不同復墾方向土壤細菌群落間比例存在差異。綱分類水平下的優勢菌種-變形桿菌（）（29.30%）、-變形桿菌（）（13.07%）在細菌分類上從屬于變形菌門，也證實了變形菌在矸石充填復墾土壤中占據主導地位。該細菌作為土壤微生物中最豐富的種群之一，在農田[33]、礦區[34]等均屬于優勢群落，是土壤中最主要的細菌類群，其代謝活動是土壤中最主要的細菌活動。酸桿菌門廣泛分布于各種惡劣的自然環境中，可以改變土壤的酸性條件，對礦山土壤酸化生態起著重要作用[35]。放線菌門具有降解和利用有機物的潛在能力[36]，是土壤養分供給的主要來源，在礦山惡劣環境中分布廣泛。Alpha多樣性分析表明，表中層草地土壤細菌Shannon_Wiener指數高于耕地、林地，Huang等[37]認為土壤表面的殘渣、土壤有機物等創造了有利于微生物的棲息地。研究區草地種植大濱菊等草本植物，具備了較為豐富的植物群落，土壤養分供給充足，有利于土壤微生物的活動，與Huang等[37]的發現類似；Chao 1指數，總體趨勢為林地＞草地＞耕地，這與蔡進軍等的研究結果一致[38]。Beta多樣性分析結果顯示，煤矸石充填復墾土壤在不同復墾方向細菌群落并無明顯差異性，土壤細菌群落組成與土層深度呈負相關，是因為隨著土壤深度的増加，能被土壤微生物分解利用的動植物殘體逐漸減少，這與焦赫等[25]的研究結果比較一致。本文研究發現，pH值同Chao1指數的變化一致，在一定程度上影響著復墾土壤微生物種群分布，但在不同復墾方向上差異不顯著，可能是由于pH值變化較為平緩（7.78＜pH＜8.30），對微生物的生長影響不明顯。

土壤細菌不僅能快速有效地分解和轉化養分[39]，影響植物對土壤肥力的獲取，而且細菌群落結構的差異和變化規律還可以反映土壤的現狀和演變，可以用來反映土壤肥力的質量[40]。本研究采取因子加權綜合法對不同復墾方向土壤肥力進行綜合評價，并依據肥力評價結果，基于冗余分析、線性回歸模型揭示了土壤細菌群落同土壤肥力指數之間的關系。冗余分析闡明了RDA模型的解釋量超過了85%，說明本研究所選取的肥力指標囊括了大部分對細菌群落作出貢獻的因子。奇古菌門、鏈霉菌屬對土壤肥力指數具有顯著的相關性，說明二者對土壤肥力的提升有著重要的作用。肖玉娜等[41]研究發現奇古菌屬于有氧氨氧化功能群和硝化功能群，可以氧化極低濃度的銨以應對采礦沉陷導致的土壤養分貧瘠環境。Brochier-Armanet等[42]認為奇古菌類微生物屬于化能自養型微生物，在氮代謝循環中起著非常重要的作用，其分類下的氧化氨生成硝酸鹽而進行化能自養生活[43]。以上研究結果證實奇古菌可以通過硝化作用促進氮代謝循壞，間接改善土壤肥力。鏈霉菌作為放線菌的主要構成類群，在自然界分布廣泛，具有代謝多樣性，能夠產生細胞外水解酶代謝糖、氨基酸和芳香族等化合物，其產生的抗生素、多氧酶素等在現代農業中應用廣泛。Dias等[44]研究發現施用鏈霉菌菌肥對干旱脅迫下種植的玉米產量有顯著影響，將耐旱的鏈霉菌接種到Cd千穗谷（），通過增加谷胱甘肽，提高過氧化氫酶活性及減少葉片中的丙二醛含量，以此增強植物對Cd的耐受性[45]。文一等[46]認為鏈霉菌具有較強的抗砷毒害能力，可作為強化蜈蚣草修復砷污染土壤的材料。這些研究結果表明，盡管鏈霉菌是產生各種抗生素的主要來源，但其產生的抗生素類物質可以特異性地作用于某些病原菌，降低其生長和繁殖速度，優化土壤微生物生存環境，間接促進土壤肥力的提升。

復墾土壤微生物多樣性和群落結構不僅受到復墾方向的影響，復墾年限、充填基質同樣會對其產生影響。侯湖平等[9]發現隨著時間的推移，復墾土壤的微生物群落結構組成會逐漸發生變化。在煤矸石充填復墾0～6a細菌群落多樣性較低，復墾15a后土壤各種性質、微生物群落均已接近正常農田土壤的水平[47]。Dangi 等[48]分析了不同復墾階段土壤微生物群落結構的變化特征，發現微生物群落結構在復墾14a基本恢復為正常土壤水平。Dimitriu等[49]的研究表明，尾礦砂充填復墾土壤中微生物量較自然土壤明顯降低，不適宜土壤微生物結構和功能的改善。董夢陽等[50]發現在以蛭石、粉煤灰為充填基質的土壤微生物中，代謝產酸能力較強的酸桿菌、放線菌等細菌成為優勢種群。目前的研究證實，復墾土壤細菌群落結構及其多樣性受到諸多因素共同影響，而多因素影響下的土壤微生物環境較為復雜。本文采取控制變量法，旨在揭示同一年限（15a）、同種充填基質（煤矸石）條件下不同復墾方向（草地、耕地、林地）對微生物多樣性及種群結構的影響，對復墾年限、充填基質及其相互影響下的微生物研究將作為下一步研究的重點。

4 結 論

1）變形菌門、酸桿菌門、放線菌門為所有樣本中的主要優勢菌門，其中變形菌門占據絕對優勢，在不同復墾方向占比均高達30%以上，優勢菌在不同樣本間變動不大，但比例會隨著土層深度增加而產生變化。

2）土壤細菌群落多樣性與豐富度整體上隨土層深度增加呈下降趨勢，40～60 cm土層細菌群落多樣性與豐富度明顯低于其他土層，在不同復墾方向不存在顯著差異性。0～20 cm和20～40 cm土層，草地Chao1指數和Shannon_Wiener指數大于耕地和林地，但差異不顯著。深層土壤細菌群落組成明顯不同于其他土層。

3）RDA分析表明，TN、SOM、AP和AK是影響土壤細菌群落組成的主要肥力因子，但部分優勢菌群對肥力因子的響應并不明顯，可能與土壤微生物群落的高度復雜性以及矸石充填的特殊性等多方面因素相關。基于回歸模型，土壤肥力指數與奇古菌門相對豐度呈極顯著正相關（＜0.01），同鏈霉菌屬呈顯著負相關（＜0.05），二者可作為復墾土壤肥力的響應細菌，通過其相對豐度的變化衡量土壤肥力狀況，助力于兩淮礦區采煤沉陷地復墾土壤生產力的提高。

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Bacterial community structure of reclaimed soil and its relationship with soil fertility

Liu Jun1, Zhang Shiwen1,2※, Song Guifang1, Wang Yang1, Zhu Yafei1, Lu Shengjun1, Lan Miao1, Xia Shasha1

(1.,,232001,;2.,232001,)

Reclaimed soil can be utilized to quickly and effectively produce under reasonable manual intervention. This study aims to clarify the influence of the reclamation on soil microorganisms in the Lianghuai coal mine area. The coal gangue filling reclaimed soil was also taken as the research object in the field investigation and sampling. Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to analyze the V4 region of specific gene fragments of soil bacteria. Biodiversity was then explored to clarify the soil bacterial community and the response to soil fertility using non-metric multi-dimensional scale analysis, redundancy analysis, variance analysis, fertility index, and regression. The results show that there was no significant effect of reclamation directions on the distribution of bacterial dominant communities from the composition, but there were different proportions of reclamation directions. Specifically,(32.42%-42.97%),(10.47%- 15.87%),(8.90%-18.28%) were the main dominant bacteria groups. Among them,occupied the most, accounting for more than 30%. Alpha diversity demonstrated that there was no significant difference in the abundance and diversity of bacterial soil samples in different reclamation directions. Some indexes also maintained stable, where the Shannon_Wiener index ranged from 6.19 to 6.85, while Chao1 index ranged from 3131.97 to 4938.37, and the Pielou index of each sample fluctuated around 0.8. Beta diversity analysis showed that there was also no significant difference in the composition of bacterial communities in different reclamation directions. Furthermore, the composition of soil bacterial communities was negatively correlated with the soil depth. The composition of soil bacteria was attributed to different living conditions in the top, middle, and bottom soil layers, such as moisture, aeration, temperature, and nutrients. The pH value was consistent with the change of the diversity index, indicating only a slight influence on the dominant microbial flora and biodiversity. A one-way analysis of variance was carried out on the soil fertility indexes of reclamation directions. It was found that the content of fertility indexes in the surface soil was much higher than that in the bottom soil in general. The fertility quality was evaluated in the order of the cultivated land > grassland > forest, where the cultivated land performed the best reclamation direction. The redundancy analysis showed that the TN, SOM, AP, and AK were the main fertility factors to determine the composition of soil bacterial communities. But some dominant bacterial communities presented no response to the fertility factors, due to the high complexity of the soil microbial community and the regional conditions. The regression model showed that the soil fertility index was positively correlated with the relative abundance of the(<0.01), and thewas negatively correlated (<0.05). Moreover, there was no strong correlation with the main dominant phylum, due to the complexity of the soil environment of the coal gangue reclaimed land. Consequently, the relative abundance ofandcan be selected as important biological indicators to evaluate soil fertility, according to the linear regression and the functional effects ofand. The finding can also provide strong theoretical support to improve the fertility and quality of the reclaimed soil with the gangue at the microbial level in the Lianghuai mining area.

reclamation; bacteria; high-throughput sequencing; community structure; soil fertility

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.21.015

S154.3

A

1002-6819(2021)-21-0124-10

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Liu Jun, Zhang Shiwen, Song Guifang, et al. Bacterial community structure of reclaimed soil and its relationship with soil fertility[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(21): 124-133. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.21.015 http://www.tcsae.org

2021-06-05

2021-09-24

安徽省自然資源科技項目（2020-K-8）；國家重點研發計劃項目（2020YFC1908601）；淮北礦業集團科技研發項目（No.2020-113）

劉俊，研究方向為礦區生態修復。Email：2020200081@aust.edu.cn

張世文，教授，博導，研究方向為礦區土地復墾與生態修復。Email：shwzhang@aust.edu.cn