松脂醇二葡萄糖苷在人和大鼠肝微粒體中的代謝比較

凌海燕， 李春沁， 楊安東， 朱 寧,2*

(1.四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041；2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，功效補肝腎、強筋骨、安胎[1]，含有木脂素、環烯醚萜、苯丙素、多糖等多種活性成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保肝、護腎、抗骨質疏松等藥理作用[2-3]。其中，木脂素有著降血壓、抗骨質疏松、保護內皮細胞修復受損皮膚作用[4-8]，并且松脂醇二葡萄糖苷為杜仲主要特征性、功能性成分[9]，具有對血壓的雙向調節活性。Xie等[10]將杜仲皮松脂醇二葡萄糖苷與人糞便懸浮液厭氧培養，得到11種代謝產物，推測其復雜的腸道代謝或肝臟首過代謝產物可能是其藥理作用來源。

微粒體體外代謝試驗快速簡便，可直接觀察酶與底物之間的相互選擇性作用，減少了諸多體內因素的干擾，能作為體內外整體研究可靠的理論來源[11]，其中肝微粒體是最有效的手段。目前，國內外尚未見松脂醇二葡萄糖苷在肝微粒體中代謝的報道，故本實驗采用高效液相色譜串聯四極桿質譜(HPLC/QQQ-MS)法比較該成分在人和大鼠肝微粒體中的代謝，以期為該成分藥理活性及作用機制的進一步研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6410B三重四級桿質譜聯用儀(美國Agilent公司)；XS205電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；MIX-25渦旋振蕩器(杭州米歐儀器有限公司)；Heraeus Multifuge X1R冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CASCADA Ⅱ超純水機(美國Pall life Science公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；KH7200E超聲波清洗儀(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 松脂醇二葡萄糖苷(成都普思生物科技股份有限公司，批號PS000870)；氯霉素(四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq20051911)。PBS緩沖液(北京匯智泰康生物科技有限公司,批號20k001)；NADPH再生系統A液、B液[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四鈉鹽還原型，北京匯智泰康生物科技有限公司，批號分別為NRS(A)-20L001、NRS(B)-20L001]。人肝微粒體(美國BioIVT Elevating Science公司，Lot#ZZQ)；雄性大鼠肝微粒體(瑞德肝臟疾病研究有限公司，批號JYYJ)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 LC-MS/MS分析

2.1.1 色譜條件 Agilent Extend-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相水(含0.5%甲酸、5 mmol/L甲酸銨)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～4 min，10%B；4～6 min，60%～90%B；6～12 min，90%B；12～15 min，90%～10%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；內標氯霉素(16.24 μg/mL)。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源；負離子模式；一級掃描、多反應監測方式；毛細管溫度400 ℃；干燥氣體積流量11 L/min；毛細管電壓4 000 V；霧化器壓力30 psi(1 psi=0.133 kPa)；松脂醇二葡萄糖苷、內標檢測離子對分別為m/z681.3～357.1、321.0～152.0，碰撞能量分別為25、20 V。

2.2 肝微粒體體外代謝體系建立和分組 孵育體系總體積為500 μL，包括PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)、各種屬肝微粒體(含20 mg/mL蛋白)、0.452 0 mg/mL(0.67 μmol/L)松脂醇二葡萄糖苷、輔酶NAPDH再生系統A液和B液(按5∶1比例臨用混合)。在試管(12 mm×75 mm)中將50 μL PBS緩沖液與360 μL超純水混合，加入50 μL冰浴上預先融化的混合肝微粒體(20 mg/L)、10 μL松脂醇二葡萄糖苷底物溶液，渦旋混勻，在37 ℃下預孵育5 min，加入30 μL NADPH再生系統啟動反應，繼續在37 ℃下孵育，于0、5、15、30、45、60、90、120 min立即加入1 mL預冷、含內標的甲醇終止反應，渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣檢測。

分別將人和大鼠肝微粒分為3組，依次為實驗組、陰性組、空白組。其中，實驗組為含松脂醇二葡萄糖苷的標準孵育體系，陰性組孵育體系中不含起始因子NAPDH，而空白組孵育體系中不含松脂醇二葡萄糖，每組3份，平行3次。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，置于量瓶中， 流動相溶解并定容至刻度，精密量取1 mL至25 mL量瓶中，流動相定容至刻度，即得。

本文中，提出了一種能夠有效降低細胞光毒性、動態追蹤并且精確量化三維細胞牽引力的3D-TFM方法。該方法將生物相容性的聚丙烯酰胺水凝膠作為細胞黏附和遷移的基底，然后在凝膠基底的表面修飾單層熒光顆粒作為人造散斑追蹤細胞的運動，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)延時采集熒光顆粒的三維位置信息，并采用基于二階形函數的數字體積相關技術計算位移場，根據基底材料的彈性模量和泊松比以及彈性力學基本理論[33]，由位移場得到應力場。

2.4 線性關系考察 取不同質量濃度松脂醇二葡萄糖苷溶液，加到熱失活的大鼠肝微粒懸浮液中，使反應液中底物最終質量濃度為0.37、0.75、1.51、3.01、6.02、15.05、30.1 μg/mL，按“2.2”項下方法操作，在“2.1”項條件下進樣測定。以松脂醇二葡萄糖苷質量濃度為橫坐標(X)，松脂醇二葡萄糖苷、內標峰面積比值為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=0.032 3X-0.017 2(R2=0.999 8)，檢測下限為6.8 ng/mL。

2.5 回收率、精密度試驗 按“2.4”項下方法制備1.35、2.70、5.40 μg/mL底物溶液，在“2.1”項條件下各進樣測定6次，測得相對回收率分別為90.5%、92.2%、95.6%，日內精密度RSD分別為2.6%、3.5%、3.2%，日間(3 d)精密度RSD分別為5.6%、4.5%、4.2%。

2.6 肝微粒體質量濃度對代謝速率的影響 設置肝微粒體質量濃度為0.2、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL，松脂醇二葡萄糖苷質量濃度為3.01 μg/mL，溫孵時間為120 min，結果見圖1。由此可知，隨著肝微粒體質量濃度增加，底物代謝速率升高，最終確定為20 mg/mL。

圖1 肝微粒體質量濃度對代謝速率的影響Fig.1 Effect of liver microsome concentration on metabolic rate

2.7 溫孵時間對松脂醇二葡萄糖苷代謝率的影響 在體外溫孵體系中加入人肝微粒體和SD大鼠肝微粒體，質量濃度分別為21.9、20 mg/mL，松松脂醇二葡萄糖在37 ℃下分別孵育0、5、15、30、45、60、90、120 min后檢測其糖苷質量濃度，發現在90～120 min時趨于穩定，最終確定孵育時間為120 min。再以被代謝量和加入量的比值計算松脂醇二葡萄糖苷代謝率，測得在人和SD大鼠肝微粒體中其代謝率分別為9.4%和4.8%，見圖2。

圖2 溫孵時間對松脂醇二葡萄糖苷代謝率的影響Fig.2 Effect of incubation time on the metabolic rate of pinoresinol diglucoside

2.8 質譜分析 松脂醇二葡萄糖苷保留時間為4.8 min，在m/z681.3處形成準分子離子[M-H]-，其二級質譜圖見圖3。由此可知，m/z519.3為m/z681.3斷裂1個糖苷鍵形成，而m/z357.3為后者斷裂2個糖苷鍵形成，特征峰強度最高。

圖3 松脂醇二葡萄糖苷二級質譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum of pinoresinol diglucoside

2.9 人肝微粒體中代謝產物分析 根據保留時間、分子離子峰、二級質譜信息對特征峰進行確認，初步確認松脂醇二葡萄糖在人肝微粒體中生成6個主要代謝產物，分別命名為M1(m/z357.3)、M2(m/z345.4)、M3(m/z331.4)、M4(m/z329.2)、M5(m/z301.4)、M6(m/z297.3)，總離子流圖見圖4。

圖4 松脂醇二葡萄糖苷總離子流圖 Fig.4 Total ion current chromatograms ofpinoresinol diglucoside

M1在保留時間4.8 min處有1個m/z357.3的準分子離子峰[M-H]-，峰質量數比底物松脂醇二葡萄糖[M-H]-少324 Da，由于該底物包含2個糖苷鍵，故推測m/z357.3可能為底物脫去2個糖基形成；底物離子681.3與M1的主要碎片離子峰相同，均為m/z151.1[M-H-C12H14O3]-，二級質譜圖見圖5A。

M2在保留時間6.67 min處有1個m/z345.4的準分子離子峰[M-H]-，主要碎片離子[M2-H-H2O]-m/z327.3，推測其可能為m/z359.3發生氧脫甲基反應得到；在m/z357.3[M-H]-峰的基礎上加2個氫還原，即1個呋喃環開環生成m/z359.3[M-H]-峰，主要碎片離子為m/z257.2、152.3，但它在反應液里僅檢測到少量，可能很容易發生脫甲基反應，進而生成m/z345.4，二級質譜圖見圖5B。

M3在保留時間6.74 min處有1個m/z331.4的準分子離子峰[M-H]-，它是m/z357.3[M-H]-發生2個呋喃環開環、1個氧脫甲基、1個脫羥基反應得到，主要碎片離子m/z313.3[M3-H-H2O]-，二級質譜圖見圖5C。

M4在保留時間6.76 min處有1個m/z329.2的準分子離子峰[M-H]-，是m/z357.3[M-H]-峰發生2個呋喃環開環、脫氫形成內酯環、2次氧脫甲基反應而得，主要碎片離子為m/z201.1[M4-110-18-H]-，即m/z201.1[M4-H-C6H6O2-H2O]-，二級質譜圖見圖5D。

M5在保留時間6.93 min處有1個m/z301.1的準分子離子峰[M-H]-，在M1結構上發生環氧開環、2次氧脫甲基、2次脫羥基反應，得到m/z301.4[M-H]-峰，碎片離子m/z265.1[M5-H-36]-，即[M5-H-2H2O]-；碎片離子m/z221.0[M5-36-44-H]-，即[M5-2H2O-COOH]-，二級質譜圖見圖5E。

M6在保留時間9.79 min處有1個m/z297.3的準分子離子峰[M-H]-，在1個m/z301.4[M-H]-的基礎上脫去4個氫形成內酯環，得到m/z297.3[M-H]-峰，主要碎片離子m/z250.9[M6-46-H]-，即[M6-HCOOH-H]-，二級質譜圖見圖5F。

圖5 松脂醇二葡萄糖苷代謝產物二級質譜圖Fig.5 Secondary mass spectra for metabolites of pinoresinol diglucoside

2.10 松脂醇二葡萄糖苷代謝途徑分析

2.10.1 人肝微粒體 見圖6。

注：1為脫糖，2為加氫、脫甲基，3為加氫、脫甲基、脫羥基，4為開環、脫氫、脫甲基，5為開環、脫甲基、脫羥基，6為脫氫成環。圖6 松脂醇二葡萄糖苷在人肝微粒體中的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of pinoresinol diglucoside in human liver microsomes

2.10.2 大鼠肝微粒體 松脂醇二葡萄糖苷代謝產物有3種，分別為M1、M2、M3，與在人肝微粒中的代謝存在差異。

3 討論與結論

本實驗建立了靈敏、快速的HPLC-QQQ/MS法來測定人和大鼠肝微粒體中松脂醇二葡萄糖苷及其代謝產物，分別初步確定了6個和3個，均以脫糖基反應為主，并且生成的苷元松脂素進一步發生還原、氧脫甲基、開環等一系列反應。通常認為，藥物代謝過程可使化合物極性增大，從而促進藥物排泄，但也有很多例外[12]，例如在腸道菌群的作用下皂苷會發生結構變化，主要是逐步脫糖過程，生成的轉化產物比原皂苷具有更好的生物利用度或更強的生物活性[13]。Kim等[14]發現，人參皂苷酶促轉化只發生去糖基化；Zhai等[15]報道，黃芪甲苷生物利用度很低，需要在腸道菌群的代謝作用下產生次生皂苷才能大大提高。

本實驗所得結果與Xie等[10]報道比較，松脂醇二葡萄糖苷在肝微粒體中的代謝產物數量較少，推測其在肝臟中的專屬代謝酶種類可能少于在腸道菌群中的生物酶，但主要代謝部位尚無法確定。松脂醇二葡萄糖苷屬于木脂素類化合物，在體內主要發生Ⅰ相代謝轉化, 即水解、氧化、去甲基化或羥基化等[16]，而且本實驗也只發現了該類代謝產物，尚未找到II相反應相關產物。

綜上所述，本實驗探討了松脂醇二葡萄糖苷在人和大鼠肝微粒體中的轉化規律，推測了主要轉化途徑及轉化產物，可為進一步研究該成分體內代謝過程提供實驗依據。