馬蹄黃總黃酮、總酚酸提取工藝優化及其抗氧化、抗菌活性研究

關奎奎， 汪 露， 李聰聰， 陳朝喜

(西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041)

馬蹄黃SpenceriaramalanaTrimen為藏區民間常用藥材，藏文名“鄔堅德爾佳”，系薔薇科馬蹄黃屬多年生草本植物，主要分布于西藏、云南、四川海拔2 950～5 000 m的山坡草地、林間草地、山坡灌叢中[1]，其味甘、苦，性寒，具有通便解毒、收斂止瀉、平衡察隆等功效，泡水代茶飲可用于治療腹脹、痢疾、高血壓等癥，水煎膏劑亦可防皸裂[1-2]，所含總黃酮具有良好的抗炎、鎮痛、止血活性[3]。Lee等[4]發現，馬蹄黃80%乙醇提取物能顯著抑制糖尿病相關的晚期糖基化終產物(AGEs)形成，并從中分離出6種能夠有效緩解高糖誘導斑馬魚視網膜透明血管擴張的原花青素；相關研究也表明，馬蹄黃甲醇浸提物對多重耐藥、具有強成膜能力的大腸桿菌具有良好的抑菌活性[5]。

大量研究表明，植物中的黃酮、酚酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、保護肝臟、保護心血管等多種生物活性，被廣泛應用于醫療、食品、動物保健等行業[6-13]。因此，本實驗采用Box-Behnken響應面法優化馬蹄黃總黃酮、總酚酸提取工藝，并評價其抗氧化、抗菌活性，以期為該植物開發利用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 馬蹄黃全草于2019年10月采自四川省甘孜州色達縣丹青藥王神山(北緯32°11′27″，東經100°25′48″，海拔3 900 m)，經西南民族大學獸醫藥理實驗室陳朝喜副教授鑒定為薔薇科馬蹄黃屬植物馬蹄黃SpenceriaramalanaTrimen新鮮全草。沒食子酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度≥92.5%)。福林酚試劑(1 mol/L)、1.1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，純度≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；L-抗壞血酸(上海易恩化學技術有限公司，純度≥99%)。其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 菌種 大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)保存于西南民族大學畜牧獸醫學院獸醫藥理學實驗室。

1.3 儀器 KQ-5200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；ZN-500A高速中藥粉碎機(長沙市岳麓區中南制藥機械廠)；4-20R醫用離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)；LGJ-10真空冷凍干燥機(北京松源華興科技有限公司)；RE-3000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；GR85DA高壓滅菌器[致微(廈門)儀器有限公司]。

2 方法與結果

2.1 提取物制備 將藥材全草風干、粉碎后過篩，精密稱取不同粉碎程度的粉末適量，加入不同體積分數乙醇，在適宜溫度水浴下超聲提取一段時間，離心取上清，減壓濃縮后冷凍干燥，即得。

2.2 總黃酮、酚酸提取率測定

2.2.1 沒食子酸線性關系考察 采用Folin-Ciocalteu法[14]。精密稱取2.040 mg沒食子酸對照品，超純水溶解定容至10 mL量瓶中，得到0.20 mg/mL對照品溶液，依次稀釋至10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，分別精密量取50 μL，加入200 μL超純水、250 μL福林酚(每1 mL加8 mL水稀釋)，室溫避光靜置5 min，加入250 μL 10%碳酸鈉，30 ℃恒溫避光1 h，采用酶標儀在765 nm波長處測定吸光度，平行3次。以沒食子酸質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=0.003 6X+0.050 4(R2=0.999 4)，在10.00～80.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.2 蘆丁線性關系考察 精密稱取2.155 mg蘆丁對照品，無水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，得到0.20 mg/mL對照品溶液，分別精密移取25、50、75、100、125、150、175、200 μL，補充無水乙醇至總體積為600 μL，加入5%亞硝酸鈉溶液50 μL，振蕩混勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液50 μL，振蕩混勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液300 μL，振蕩混勻后靜置15 min，采用酶標儀在508 nm波長處測定吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程為A=0.001 8X+0.039 2(R2=0.999 7)，在8.33～66.67 μg/mL范圍內線性關系良好

2.3 單因素試驗 分別考察乙醇體積分數(10%、30%、50%、70%、90%)、提取時間(10、30、50、70、90 min)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)、粉碎程度(20、40、60、80、100目)對總黃酮、總酚酸提取率的影響。結果，隨著乙醇體積分數升高，兩者提取率先升后降，在50%時最高；總黃酮提取率隨著提取時間延長而升高，50 min后基本趨于穩定，而總酚酸提取率在50 min后呈下降趨勢；液料比較低時，溶出物質量濃度較高而出現飽和，從而抑制兩者溶出，而液料比較高時，有限量藥材不足以使溶液發揮最大溶出效率，在40∶1時最高；總黃酮提取率在40 ℃下最高，而總酚酸在50 ℃下才達到最大值，但隨著提取溫度進一步增加，兩者提取率均降低，可能是由于高溫會導致其分解或使得其他雜質溶出所致；粉碎程度為20目時，總酚酸提取率顯著低于40目以上時，但總黃酮提取率在粉碎程度80、100目時反而降低，可能與其他優先溶出雜質產生的抑制作用有關。

2.4 提取工藝優化

2.4.1 Plackett-Burman設計 在單因素試驗基礎上，以總黃酮、總酚酸提取率為響應值，采用Minitab 16軟件進行Plackett-Burman設計[15]，共12組，每組重復3次，結果見表1，方差分析見表2。由此可知，模型P均<0.01，R2、AdjR2、PredR2均在可接受范圍內，表明它能準確預測影響因素顯著性；X2(提取時間)、X3(提取溫度)、X5(粉碎程度)均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)；各因素影響程度依次為X3(提取溫度)>X5(粉碎程度)>X2(提取時間)>X4(液料比)>X1(乙醇體積分數)。

表1 Plackett-Burman設計結果

表2 Plackett-Burman設計方差分析

2.4.2 Box-Behnken響應面法 依據單因素試驗、Plackett-Burman設計結果，固定乙醇體積分數為50%，液料比為40∶1，以提取時間(A)、提取溫度(B)、粉碎程度(C)為影響因素，總黃酮(Y1)、總酚酸(Y1)提取率為評價指標，采用Box-Behnken響應面法優化提取工藝，結果見表3。

表3 Box-Behnken響應面法設計與結果

通過Design expert 8.0.6軟件對表3數據進行分析，得回歸方程分別為Y1=10.66+0.85A+1.09B+0.63C-0.82AB-0.47AC-0.38BC-0.87A2-1.05B2+1.00C2、Y2=29.57+2.05A+2.45B+1.44C-1.49AB-0.027AC-1.09BC-4.23A2-2.47B2+3.09C2，方差分析見表4。由此可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，R2、AdjR2、PredR2均在可接受范圍內，表明模型具有較高的擬合度和可信度；變異系數均小于10，表明模型精確度較高；信噪比>4，表明模型能較好地對提取工藝進行分析預測；Y1、Y2一次項A、B、C均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)，其排序與“2.4.1”項下一致，表明結果準確性較高，并且Y1二次項AB及兩者平方項A2、B2、C2也均有顯著影響(P<0.05，P<0.01)。

表4 Box-Behnken響應面法方差分析

響應面分析見圖1～2，可知各因素對總黃酮、總酚酸提取率的影響程度相似，均主要為提取溫度和提取時間，并隨著兩者增加提取率先升后降，與單因素試驗結果一致；雖然粉碎程度對兩者提取率的影響均較為平緩，但整體而言，其程度較高仍是保證高提取率的必要條件。

圖1 各因素響應面圖(總黃酮提取率)Fig.1 Response surface plots for various factors (extraction rate of total flavonoids)

圖2 各因素響應面圖(總酚酸提取率)Fig.2 Response surface plots for various factors (extraction rate of total phenolic acids)

2.4.3 驗證試驗 根據Box-Behnken響應面法結果，得到最優工藝為提取時間33.2 min，提取溫度42.51 ℃，粉碎程度60目，乙醇體積分數50%，液料比40∶1，總黃酮、總酚酸提取率分別為34.44%、12.41%，根據實際情況，將其修正為提取時間33 min，提取溫度43 ℃，粉碎程度60目，乙醇體積分數50%，液料比40∶1。在上述優化工藝下進行3批驗證試驗，測得總黃酮提取率分別為34.87%、34.96%、34.84%，平均值34.89%；總酚酸提取率分別為11.41%、12.73%、12.49%，平均值12.21%，分別與預測值34.44%、12.41%接近，表明該工藝穩定可靠。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 DPPH自由基清除能力 參考文獻[16]報道，并略作改動。取0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL提取物溶液各100 μL，與100 μL DPPH溶液(0.05 mg/mL)置于96孔板中充分混勻，37 ℃避光靜置20 min，在517 nm波長處測定吸光度Ai；用乙醇代替提取物，在相同條件下測定吸光度A0；用乙醇代替DPPH溶液，在相同條件下測定吸光度Aj，以L-抗壞血酸為陽性對照，重復3次，計算對DPPH自由基的清除率，公式為清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%，結果見圖3。由此可知，提取物對DPPH自由基的清除率與其質量濃度呈正相關，IC50為0.012 mg/mL。

圖3 提取物對DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of extract on DPPH free radical

2.5.2 羥基自由基清除能力 采用Fenton反應，其機制為H2O2與Fe2+反應產生·OH，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質，抗氧化物能清除·OH而使體系顏色變淺，可間接檢測·OH含量[17]。取0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL提取物溶液各400 μL，依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各200 μL，混勻后37 ℃靜置30 min，在510 nm波長處測定吸光度Ai；用乙醇代替提取物，在相同條件下測定吸光度A0；用純水代替H2O2溶液，在相同條件下測定吸光度Aj，以L-抗壞血酸為陽性對照，重復3次，計算對羥基自由基的清除率，公式為清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%，結果見圖4。由此可知，提取物對羥基自由基的清除能力隨著其質量濃度增加而升高，IC50為0.72 mg/mL。

圖4 提取物對羥基自由基的清除率Fig.4 Scavenging rates of extract on hydroxyl free radical

2.5.3 總還原能力 參考文獻[18]報道，并略作改動。取0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL提取物溶液各250 μL，加入250 μL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、250 μL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃恒溫反應20 min后置于冰盒中迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液250 μL，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清500 μL，加入400 μL蒸餾水、100 μL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，以L-抗壞血酸為陽性對照，在700 nm波長處測定吸光度，重復3次，結果見圖5。由此可知，吸光度在一定范圍內隨者其質量濃度增加呈線性增長，即總還原能力逐漸增強。

圖5 提取物總還原能力Fig.5 Total reduction capacity of extract

2.6 抗菌活性研究 采用K-B法，凍干粉用甲醇溶解制成50 mg/mL工作液，稀釋后分多次滴加于滅菌紙片(6 mm)上，制得載藥量分別為2、1、0.5 mg的載藥紙片，同時以浸泡甲醇的紙片為空白對照。將紙片貼附于事先涂布100 μL菌懸液(1×105CFU/mL)的MH瓊脂平板上，37 ℃培養16 h后測定抑菌圈直徑，判定標準為高敏(直徑>20 mm)、中敏(直徑10～20 mm)、輕敏或耐藥(直徑<10 mm)，結果見圖6。由此可知，提取物對各菌株均有較顯著的抑制作用，表現為輕敏或中敏，并呈量效關系。

圖6 提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論與結論

黃酮和酚酸是植物中生物活性廣泛的2類成分，具有重要的研發價值，故本實驗優化馬蹄黃中兩者提取工藝。目前，關于該植物所含成分的基礎研究有限，故分別以蘆丁、沒食子酸當量為兩者含量進行評價，發現影響其提取率的條件存在一定差異，可能與理化性質有關。Box-Behnken響應面法中各因素的顯著性與Plackett-Burman設計一致，表明該方法具有較高的準確性和重復性，同時驗證試驗結果與預測值一致，表明最優工藝穩定可靠。

抗氧化活性實驗結果顯示，馬蹄黃提取物對DPPH自由基具有較強的清除能力，但清除率最高僅在80%左右，可能與完全清除DPPH后產生的淡黃色背景有關；對羥基自由基的清除能力較弱，其原因可能是反應體系中H2O2與Fe2+反應所產生的Fe3+與提取物中的酚類結合，形成藍黑色產物，致使吸光度偏高，故清除率隨著其質量濃度增加表現出更平緩的增長趨勢。總還原能力實驗結果顯示，馬蹄黃提取物具有較強的Fe2+還原能力。藥敏實驗結果顯示，馬蹄黃提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。

綜上所述，本實驗所優化的馬蹄黃總黃酮、酚酸提取工藝穩定可靠，提取物具有較好的抗氧化、抗菌活性，可為該植物開發利用提供參考。