玉泉丸對糖尿病腎病大鼠GSK-3β/Nrf2通路及YKL-40表達的影響

陳 燁， 賈崇高， 唐英騫， 王 昱

(貴州醫科大學附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發癥之一，約50%的患者會被最終確診[1]，它也是導致終末期腎衰竭的主要原因[2]。玉泉丸是由葛根、天花粉、地黃、麥冬、五味子、甘草組成的中成藥，具有養陰生津、止渴除煩、益氣和中等功效，能降低2型糖尿病患者血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平，減輕炎癥反應[3]。

腎小球內皮損傷是引起炎癥反應及糖尿病腎病發生和發展的重要特征[4]，幾丁質酶-3樣蛋白-1(chtinase-3-like protein-1，YKL-40)在多種炎癥疾病中高表達，被公認為早期診斷糖尿病腎病的潛在生物標志物[5]。細胞核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是內源性抗氧化反應的主要調節因子[6]，鋅可通過上調Nrf2及其下游因子蛋白表達和糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)磷酸化水平延緩糖尿病腎病的發展[7]。目前，玉泉丸對大鼠GSK-3β/Nrf2通路及腎小球內皮損傷標志物YKL-40表達的影響尚無報道，故本研究采用高脂高糖飼料喂養結合一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備大鼠糖尿病腎病模型，研究該制劑對GSK-3β/Nrf2通路及腎小球內皮損傷標志物YKL-40表達的影響，為其臨床相關治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 健康SPF級SD大鼠(雄性，體質量200～220 g，6～8周齡)購自貴州醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK(黔)2018-0001，符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規定，按照3R原則給予人道的關懷照顧。實驗前于12 h/12 h光暗循環、溫度20～25 ℃、相對濕度60%～70%條件下，單籠、普通飼料適應性飼養1周。

1.2 藥物 玉泉丸購自成都九芝堂金鼎藥業有限公司(0.15 g/丸，國藥準字Z51021085，批號20191209)，與生理鹽水配制成質量濃度為0.4、0.8、1.2 g/mL的混懸液。鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(0.5 g/片，國藥準字H20023370，批號20200327)，與生理鹽水配制成質量濃度為5 mg/mL的混懸液。

1.3 試劑和儀器 大鼠YKL-40、內皮素(endothelin，ET)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，批號分別為2396-40、256353-34；TNF-α、IL-6、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司，批號分別為ml821037、ml005039-C、ml510373、ml148201、ml053049-J；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司，批號分別為BC4705、BC4913；STZ(純度>98%)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司，批號分別為L2817、L2910、L3015；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為ZA-0211、ZA-0614；磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、GSK-3β、Nrf2鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司，批號分別為ab50163、ab50227、ab30549、ab1003。CL-7000型全自動生化分析儀購自日本島津公司；尼康SMZ745型光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；Fax-2100型酶標儀購自美國INStat公司；ChemiDoc-MP型凝膠成像分析系統購自山東三瑞科技有限公司；1704150型轉膜儀、CHEF Mapper XA型電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 大鼠經適應性喂養1周后，選取健康、狀態良好、血糖正常者，采用Zhao等[8]報道的方法制備糖尿病腎病模型，隨機分為造模組(54只)和正常組(10只)，造模組大鼠高脂高糖飼料喂養8周后，一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg，STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液中)，繼續使用高脂高糖飼料喂養；正常組大鼠普通飼料喂養8周后，注射等體積檸檬酸鹽緩沖液，繼續使用普通飼料喂養。連續喂養4周后，檢測大鼠尿量及尿蛋白排泄率，糖尿病造模成功標準為腹腔注射STZ 72 h后，靜脈血糖高于16.7 mmol/L；糖尿病腎病造模成功標準為尿量>原尿量150%，尿蛋白排泄率>30 mg/24 h[9]。54只造模組大鼠中死亡1只，未造模成功3只，將造模成功的50只再隨機分為模型組，玉泉丸低、中、高(4、8、12 g/kg)劑量組[10]和二甲雙胍(50 mg/kg)組[11](陽性對照)，各組灌胃給予對應劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予生理鹽水，灌胃容量均為10 mL/kg，每天1次，連續21 d。

2.2 大鼠生化指標檢測 末次給藥結束后收集大鼠24 h尿液，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)深度麻醉以實施安樂死，采集靜脈血約10 mL，其中5 mL于3 000 r/min離心5 min后取血清(剩余5 mL置于-80 ℃冰箱中，用于后續ELISA檢測)，采用免疫透射比濁法，通過全自動生化分析儀檢測血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平。

2.3 HE染色觀察大鼠腎組織病理學變化 大鼠實施安樂死后摘取雙腎，迅速將右側腎組織置于4%多聚甲醛中固定，而左側腎組織置于-80 ℃冰箱中，用于后續ELISA和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測，組織脫水，石蠟包埋，切片機切成5 μm薄片，按照HE染色試劑盒說明書進行染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化。根據發生病變腎小管和腎小球(腎小球萎縮，腎小管出現胞漿脫落及管腔擴張，間質區出現炎性細胞浸潤)所占總腎小管和腎小球的比例進行評分[12]，未發生病變計為0分，病變面積<25%計為1分，病變面積≥25%但<50%計為2分；病變面積≥50%但<75%計為3分；病變面積≥75%計為4分。

2.4 ELISA檢測大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平 取“2.2”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠血液，低溫融化，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，嚴格按照相關試劑盒說明書操作方法檢測YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平，平行6次。

2.5 ELISA檢測大鼠腎組織SOD、CAT活性和MDA水平 取“2.3”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠腎組織，于冰臺上用生理鹽水制成組織勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心15 min后取組織上清液，嚴格按照相關試劑盒說明書操作方法，采用酶標儀檢測SOD、CAT活性和MDA水平。

2.6 免疫組織化學法檢測大鼠腎組織YKL-40表達 將“2.3”項下大鼠腎組織切片，常規脫蠟至水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)高溫修復抗原，3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，加入YKL-40鼠抗(1∶150)，37 ℃孵育30 min后4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶100)，ECL試劑盒顯色5～20 min后在光學顯微鏡下觀察，隨機選取5個腎小球視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析棕黃色顆粒部分面積占視野總面積的比值，即為YKL-40陽性表達指數值(positive index，PI)。

2.7 Western blot法檢測大鼠腎組織GSK-3β、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達 取“2.3”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠腎組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量，取50 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉聚偏二氟乙烯膜，抗體封閉，1∶2 000稀釋后的GSK-3β、p-GSK-3β、Nrf2、β-actin鼠抗4 ℃過夜孵育，添加含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像分析系統拍照，以β-actin為內參檢測蛋白表達，平行3次。

3 結果

3.1 玉泉丸對大鼠生化指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平降低(P<0.01)，見表1。

3.2 玉泉丸對大鼠腎組織病理學變化的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎小球直徑縮小，系膜區基質增多，腎小管出現不同程度的空泡樣變性和胞漿脫落，部分可見腎小管管腔，間質區出現大量炎性細胞浸潤，腎組織病理學評分升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎小球直徑增大，系膜基質增生減輕，腎小管損傷趨于修復，炎性細胞浸潤減少，腎組織病理學評分降低(P<0.01)，見圖1、表2。

表1 各組大鼠生化指標

注：藍色箭頭表示腎小球萎縮，黑色箭頭表示腎小管胞漿脫落及管腔擴張，黃色箭頭表示間質炎性細胞浸潤。圖1 各組大鼠腎組織病理變化(×400)Fig.1 Renal tissue histopathological changes of rats in various groups (×400)

表2 各組大鼠腎組織病理評分(分，

3.3 玉泉丸對大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平降低(P<0.01)，見表3。

3.4 玉泉丸對大鼠腎組織SOD、CAT活性及MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SOD、CAT活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織SOD、CAT活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見表4。

表3 各組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平

3.5 玉泉丸對大鼠腎組織YKL-40表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織YKL-40陽性表達指數升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織YKL-40陽性表達指數降低(P<0.01)，見圖2、表5。

表4 各組大鼠腎組織SOD、CAT活性及MDA水平

圖2 各組大鼠腎組織YKL-40表達(×400)Fig.2 Renal tissue YKL-40 expressions in rats in various groups (×400)

表5 各組大鼠腎組織YKL-40表達陽性指數

3.6 玉泉丸對大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達升高(P<0.01)，見圖3、表6。

注：A為正常組，B為模型組，C為玉泉丸低劑量組，D為玉泉丸中劑量組，E為玉泉丸高劑量組，F為二甲雙胍組。圖3 各組大鼠腎組織GSK-3β、Nrf2蛋白表達Fig.3 Renal tissue protein expressions of GSK-3β and Nrf2 in rats in various groups

4 討論

玉泉丸在臨床上適用于治療因胰島素功能減退而引起的物質代謝、碳水化合物代謝紊亂，消渴癥、肺胃腎陰虧虛、熱病后期等病癥[13]。本研究發現，玉泉丸降低糖尿病腎病大鼠TNF-α、IL-6、MDA水平，繼而減少腎組織間質區炎性細胞浸潤，并呈劑量依賴性地降低糖尿病腎病大鼠血糖和血脂水平，提高腎組織SOD和CAT活性，這些變化伴隨著糖尿病腎病大鼠24 h尿微量白蛋白的減少、腎功能的改善以及腎組織損傷的緩解，與彭聰等[14]報道在2型糖尿病腎病患者中玉泉丸所發揮的腎臟保護機制一致，表明玉泉丸可通過降低血糖血脂、炎性因子浸潤及氧化應激反應，從而減少腎組織損傷，改善腎功能。

表6 各組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β、Nrf2蛋白表達

長期高糖會產生血管病變，進而引起血管損傷，YKL-40在糖尿病腎病中發揮重要作用[15]。在本研究中，糖尿病腎病大鼠模型YKL-40和ET水平升高，伴隨著腎小球直徑縮小、系膜區基質增多，腎小管出現不同程度的空泡樣變性和胞漿脫落，使腎組織病理學評分升高。隨著玉泉丸劑量的升高，YKL-40和ET水平依次降低；腎組織損傷逐漸減輕，腎組織病理學評分逐漸降低，推測玉泉丸減少腎組織損傷，改善腎功能可能與糖尿病腎病大鼠腎小球內皮損傷標志物YKL-40水平緊密相關。

糖尿病腎病由多種因素相互作用引起，包括炎癥介質、致纖因子、氧化應激和細胞凋亡等[16]。本研究發現，模型組大鼠p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達降低，提示GSK-3β/Nrf2通路在糖尿病腎病大鼠模型中處于抑制狀態，與Yu等[17]研究發現高糖誘導的心肌細胞中，p-GSK-3β和Nrf2蛋白表達下調，心肌細胞受損的研究結果具有一致性。激活GSK-3β/Nrf2抗氧化途徑可減輕糖尿病腎病引起的腎損傷[18]，Nrf2的上調參與非諾貝特對1型糖尿病腎病小鼠的腎臟保護作用[19]。Feng等[20]研究發現右美托咪定可通過激活GSK-3β/Nrf2信號通路抑制炎癥和氧化應激，改善脂多糖誘導的大鼠急性腎損傷。本研究發現玉泉丸能提高p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達，且呈劑量依賴性，與上述研究結果一致，因此推測玉泉丸可能通過激活GSK-3β/Nrf2通路，降低腎小球內皮損傷標志物YKL-40水平，減輕氧化應激和炎癥反應。

綜上所述，在STZ誘導的糖尿病腎病大鼠模型中，玉泉丸可有效降低腎小球內皮損傷標志物YKL-40表達，降低血糖和血脂，減輕氧化應激和炎癥反應，改善腎功能，可能與激活GSK-3β/Nrf2通路有關，可為相關臨床治療提供參考。