扶金化積丸對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及機制

夏小軍， 雷旭東， 段 赟， 陳浩方， 郭炳濤， 馬 駿， 趙文秀， 李文基

(1.甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730050)

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因，全球每年大約有100萬人死于該病[1]，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌病例的85%，有70%患者表現為局部晚期或轉移[2]。在過去幾十年里，雖然手術、放療、化療等傳統手段不斷取得進展，但其不良反應和耐藥性是降低肺癌患者生存質量和存活率的主要原因，已成為相關治療的瓶頸[3-4]。

腫瘤負荷、侵襲、轉移是肺癌治療失敗和預后不良的主要影響因素[5]，故需要開發高效、低毒、多靶點的新型藥物。中醫藥具有來源廣、成本低、不良反應少、靶點多等諸多優勢，而且與傳統放化療相比在預防腫瘤復發轉移方面具有優勢[6]。本研究探討扶金化積丸對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長、臟器指數、機體免疫、NF-κB、MMP-9蛋白表達的影響，以期為相關臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 動物及瘤株 C57BL/6小鼠48只，雄性，體質量(20±2)g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供，動物生產許可證號SCXK(甘)2015-0001，合格證號0000952。Lewis肺癌細胞株購自和元生物技術(上海)股份有限公司。

1.2 試劑與藥物 扶金化積丸由甘肅省腫瘤醫院提供，批號20190325；貞芪扶正顆粒(甘肅扶正藥業科技股份有限公司，批號Z62020415)。RPMI-1640培養基(美國Thermo公司，批號AE24464298)；0.25%胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司，批號T3926890)；胎牛血清(美國Life Technologies Corporation公司，批號42G327016)；小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-2試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號1906M)；中性樹膠、蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，批號G8590、G1080)；MMP-9抗體(美國Proteintech公司，批號0066523)；NF-κB抗體(美國Gene Tex公司，批號41556)。

1.3 儀器 全自動血液分析儀(上海涵飛醫療器械有限公司)；包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；電子天平(慈溪市天東衡器廠)。

2 方法

2.1 藥液配制 扶金化積丸用生理鹽水分別配制成質量濃度為0.087 5、0.043 7、0.021 9 g/mL的藥液(即為高、中、低劑量組)，貞芪扶正顆粒用生理鹽水配制成質量濃度為0.25 g/mL的藥液。

2.2 建模、分組及給藥 將Lewis細胞株于1640培養基(含10% FBS、1%雙抗)中培養，0.25%胰酶(含EDTA、酚紅)消化，調整細胞密度約為2×106/mL。40只小鼠右腋皮下接種細胞懸液0.2 mL/只建立荷瘤模型，接種約1周后待腫瘤長至0.5 cm時，將其隨機分為荷瘤對照組，陽性組(貞芪扶正顆粒5 g/kg，相當于臨床人用量的30倍)即扶金化積丸高、中、低劑量組(劑量分別為1.749、0.875、0.437 g/kg，分別相當于臨床人用量的30、15、7.5倍)，每組8只，另取8只小鼠作為正常組，除正常組、荷瘤對照組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水外，其他各組小鼠均按0.02 mL/g劑量灌胃給予相應藥物，每天1次，共14 d。停藥1 h后，稱定小鼠體質量，眼球采血，再脫頸椎處死，取瘤體、胸腺、脾臟待測。

2.3 小鼠瘤質量、瘤體體積、抑瘤率檢測 游標卡尺測量小鼠瘤體長、短徑，稱定質量，計算瘤體體積、抑瘤率，公式為瘤體體積=長徑×短徑2、抑瘤率=[(荷瘤對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/荷瘤對照組平均瘤質量]×100%。

2.4 小鼠臟器指數檢測 稱定小鼠胸腺、脾臟質量，計算器官指數，公式為器官指數=(器官濕重/體質量)×100%。

2.5 小鼠血常規檢測 采用全自動血液分析儀，檢測小鼠血細胞計數及HGB水平。

2.6 小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平檢測 采用ELISA法檢測小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平，操作嚴格按照相關試劑盒說明書進行。

2.7 小鼠瘤組織病理學檢測 小鼠瘤組織在10%甲醛溶液中固定24 h后置于包埋盒中，流水清洗30 min，不同體積分數(由低到高)乙醇脫水，二甲苯透明瘤組織，浸蠟包埋成塊，切成薄片，脫蠟水化，HE染色，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.8 小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達檢測 取小鼠瘤組織適量，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，自來水沖洗，檸檬酸鈉加熱修復抗原，3%H2O2孵育封閉內源性過氧化物酶，PBS漂洗，一抗(1∶200)、二抗依次孵育，PBS漂洗后，DAB(1∶20)顯色，當呈現棕黃色時終止顯色反應，蘇木素復染約1 min，不同體積分數(由低到高)乙醇脫水，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下拍照。采用圖像分析軟件，對瘤體中NF-κB、MMP-9表達進行檢測。

3 結果

3.1 扶金化積丸對小鼠瘤質量、瘤體體積、抑瘤率的影響 如表1所示，扶金化積丸高、中劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠瘤質量、瘤體體積均小于荷瘤對照組(P<0.05，P<0.01)。

表1 扶金化積丸對小鼠瘤質量、瘤體體積、抑瘤率的影響

3.2 扶金化積丸對小鼠臟器指數的影響 如表2所示，扶金化積丸高劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠胸腺、脾臟指數均高于荷瘤對照組(P<0.05，P<0.01)；與扶金化積丸高劑量組比較，扶金化積丸低劑量組小鼠胸腺、脾臟指數均降低(P<0.05，P<0.01)。

表2 扶金化積丸對小鼠臟器指數的影響

3.3 扶金化積丸對小鼠血常規的影響 如表3所示，荷瘤對照組小鼠RBC、PLT、WBC數量及HGB水平均低于正常組(P<0.01)；與荷瘤對照組比較，扶金化積丸高、中劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠RBC、WBC、PLT數量及HGB水平均升高(P<0.05，P<0.01)，而扶金化積丸低劑量組上述指標無明顯變化(P>0.05)。

3.4 扶金化積丸對小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影響 如表4所示，與荷瘤對照組比較，扶金化積丸高劑量組及貞芪扶正顆粒組小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平均升高(P<0.05，P<0.01)，扶金化積丸中劑量組IFN-γ水平升高(P<0.05)。

表3 扶金化積丸對小鼠血常規的影響

3.5 扶金化積丸對小鼠瘤組織形態的影響 如圖1所示，荷瘤對照組腫瘤細胞排列緊密，形態結構穩定，核固縮罕見，偶見局灶性壞死，瘤組織血供充盈；貞芪扶正顆粒組瘤細胞呈條索狀分布，出現瘤組織不同程度壞死、病理性核碎裂，瘤組織內及其周圍血供較少，核固縮較多，胞漿顏色較深；扶金化積丸各劑量組隨著劑量增加，壞死區域逐漸增大，低劑量組有少量出血，而高劑量組有明顯壞死及出血情況，出現細胞凋亡。

3.6 扶金化積丸對小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達的影響 如圖2～3、表5所示，荷瘤對照組小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9呈高表達；與荷瘤對照組比較，扶金化積丸高劑量組、貞芪扶正顆粒組小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達均降低(P<0.01)，中劑量組MMP-9表達降低(P<0.05)。

表4 扶金化積丸對小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平的影響

圖1 各組小鼠瘤組織形態(×200)Fig.1 Morphologies of mouse tumor tissues in various groups (×200)

4 討論

中醫藥作為補充替代治療的重要組成部分，由于其不良反應小、成本低、臨床療效好，常被用于肺癌的維持治療[7]，中藥復方治療是其最重要的特點特點之一[8]。肺癌是一種與身體狀態有關的全身性疾病，治療策略強調通過多個靶點系統性調整，改善全身而產生治療效果，而不是單純的清除腫瘤或殺死癌細胞[9]。本研究結果顯示，扶金化積丸可有效地抑制腫瘤生長，具有很好的抗癌效果。

表5 扶金化積丸對小鼠瘤組織NF-κB、MMP-9表達的影響

扶金化積丸是甘肅省腫瘤醫院根據中醫辨證施治理論研制出的純中藥制劑，用于肺癌的臨床治療，考慮到肺癌患者肺氣不足、正氣虧虛的特點，將一部分飲片提取濃縮，另一部分粉碎成細粉，以適量水為為黏合劑，制成濃縮丸。方中君藥西洋參補氣養陰、清熱生津；臣藥黃芪補氣固表，岷當歸補血止血，雞血藤行血補血，生脈散(《內外傷辨惑論》[10])、百合養陰潤肺、生津止咳，二至丸(《醫便》[11])、山萸肉補益肝腎、滋陰止血；佐藥消瘰丸(《中醫方劑臨床手冊》[12])清熱化痰、軟堅散結，龍葵散瘀消腫、清熱解毒，莪術、川芎活血行氣止痛；使藥薏苡仁滲濕健脾，山楂散瘀化積、助運脾胃，諸藥合用，對因痰、瘀、毒而致氣陰兩虛的肺積，可共奏益氣養陰、扶正祛邪之功效。

研究表明，中藥主要是通過調節免疫系統發揮抗腫瘤作用[6]；本研究結果顯示，扶金化積丸的抗肺癌活性可能與增強免疫器官功能、調節細胞因子的產生有關。血清細胞因子在免疫系統調節宿主防御中起著重要作用，IL-2能促進應答性T細胞的增殖，IFN-γ在抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡中發揮重要作用[13-14]。海參提取物被報道可通過上調細胞因子TNF-α、IFN-γ誘導有效的宿主保護性免疫反應[15]；本研究結果顯示，扶金化積丸處理可有效上調小鼠血清細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平，增強免疫防御功能。

NF-κB是一種調節多種基因表達的轉錄因子，參與細胞凋亡、炎癥反應、病毒復制和各種自身免疫性疾病過程等[16]，在腫瘤發生過程中可通過上調其表達來參與細胞增殖、轉移、血管生成和抑制凋亡的基因促進腫瘤進程[17]。目前，用于肺癌治療的NF-κB抑制劑正在進行臨床試驗，并取得良好的療效[18]。在NSCLC中，MMP-9活性與遠處轉移呈正相關，此外Meta分析顯示其過表達是腫瘤分期及不良預后的危險因素之一[19]。本研究結果表明，扶金化積丸可有效抑制瘤組織NF-κB和MMP-9的表達，從而發揮抗腫瘤作用，可為探討該制劑對肺癌的潛在治療作用提供科學依據。