基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法的耳聾膠囊化學成分辨識及歸屬

李 偲， 張東旭， 劉羽康， 張愛杰， 劉興超， 樊慧蓉*

(1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.中國醫學科學院放射醫學研究所，天津 300192；3.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；4.河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心，河北 石家莊 050200)

耳聾丸收載于2020年版《中國藥典》一部，由龍膽、黃芩、梔子、地黃、木通、當歸、澤瀉、九節菖蒲、羚羊角、甘草組成，具有清肝瀉火、利濕通竅之功效，臨床上常用于肝膽濕熱所致的頭暈頭痛、耳聾耳鳴和耳內流膿等病癥。耳聾膠囊由耳聾丸組方藥材經現代制藥工藝加工而成，具有生物利用度高、服用方便等優點，療效顯著[1-3]。

目前，關于耳聾膠囊化學成分尚缺乏系統研究，僅有少數報道針對黃芩苷[4-5]和梔子苷[5]進行含量測定，無法全面反映該制劑活性物質。本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法，結合對照品、HR-MS/MS Spectral Library1.1質譜數據庫及文獻報道對耳聾膠囊化學成分進行鑒定，并明確其藥材歸屬，完善其化學成分譜，以期為其后續藥效物質基礎和質量控制研究奠定基礎。

1 材料

Nexera UPLC LC-30A色譜儀(日本島津公司)；Triple TOF 4600高分辨質譜儀、Analyst 1.7.1 色譜工作站、PeakView 2.2 數據處理系統(美國AB Sciex公司)；色譜柱(上海沃特世科技有限公司)。

耳聾膠囊(唐山景忠山國藥有限公司，批號190802)。對照品甘草素(批號ZZS-20-076-A4)、綠原酸(批號ZZS-20-114-A8)、龍膽苦苷(批號ZZS-20-193-D6)、黃芩苷(批號ZZS-20-103-A1)、黃芩素(批號ZZS-19-017-A6)、漢黃芩素(批號ZZS-20-193-N5)、23-乙酰澤瀉醇B(批號ZZS-20-193-K2)、木通苯乙醇苷B(批號ZZS-20-193-P7)、阿魏酸(批號ZZS-20-087-B5)、藁本內酯(批號ZZS-20-196-A2)、甘草酸(批號ZZS-20-193-O6)、甘草次酸(批號ZZS-20-196-A7)、京尼平(批號ZZS-20-196-J9)、京尼平苷酸(批號ZZS-20-193-M9)、原兒茶酸(批號ZZS-20-104-A2)均購自甄準生物科技有限公司；梔子苷(批號110749-201718)、甘草苷(批號111610-201607)、山柰酚(批號D3ON-QH1T)、槲皮素(批號110759-201105)、熊果酸(批號110742-201622)均購自中國食品藥品鑒定研究院；7-羥基香豆素(批號50112)購自Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；毛蕊花糖苷(批號wkq16062004)、梓醇(批號wkq17030904)、甘草酸銨(批號wkq16082203)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；5-羥甲基糠醛(批號G1040044)購自DRC公司；丁香酚(批號D-064-161216)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇(美國Fisher Scientific公司)、甲酸(天津大茂化學試劑有限公司)均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×100 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，96% B；2～6 min，96%～35% B；6～41 min，35%～0% B；41～48 min，0% B；48～48.5 min，0%～96% B；48.5～56 min，96% B)；體積流量0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧正、負離子模式，MS掃描范圍m/z50～1 000，MS2掃描范圍m/z50～1 000；離子源溫度500 ℃；離子噴霧電壓5 500 V/-4 500 V；離子源氣體1、2均為60 psi(1 psi=6.895 kPa)；氣簾氣壓力35 psi；去簇電壓±40 V；MS碰撞能±10 eV，MS2碰撞能±35 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各固體對照品適量，加甲醇溶解制成含各成分1 mg/mL的溶液，各取100 μL混合，甲醇稀釋至20 μg/mL，即得，過0.22 μm微孔濾膜后進樣分析。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取膠囊內容物1 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入65%甲醇20 mL，超聲(250 W、40 kHz)處理50 min，放冷，65%甲醇補足減失質量，12 000 r/min離心5 min后取上清液過0.22 μm微孔濾膜，續濾液稀釋10倍，即得。

2.2.3 數據處理與分析 對于有對照品的成分，通過比對對照品及其保留時間和質譜碎片特征進行鑒定；對于沒有對照品的成分，一是應用Analyst IF1.7.1、Peakview2.2軟件結合HR-MS/MS Spectral Library 1.1數據庫在規定的質量數偏差5×10-6內對供試品溶液化學成分的保留時間和質譜信息進行比對分析；二是通過查閱中英文相關文獻，收集已報道的組方藥材中化學成分信息，包括名稱、分子式、CAS號、化學結構及質譜碎片離子信息等，建立耳聾膠囊的初步化學成分數據庫。最終，采用“對照品-數據庫-文獻報道”綜合分析策略對耳聾膠囊所含化學成分進行鑒定和辨識。

3 結果

基峰色譜圖見圖1，共鑒定出130種成分，包括46種黃酮及其苷類、30種萜類、10種苯酞類、4種香豆素類、6種苯乙醇苷類、12種有機酸類、13種含氮類、9種其他類，其中9種來源于君藥龍膽，21種來源于臣藥黃芩，36種來源于臣藥梔子，16種來源于地黃，3種來源于木通，11種來源于澤瀉，19種來源于當歸，4種來源于九節菖蒲，9種來源于羚羊角，23種來源于甘草，山柰酚為龍膽和梔子的共有成分，綠原酸及亞油酸為梔子和當歸的共有成分，蔗糖和棕櫚酸歸屬于全部藥味。各成分鑒定結果和藥材歸屬結果見表1(化合物1～66為正離子模式下檢測得到，化合物67～130為負離子模式下檢測得到)。

3.1 黃酮類 該類化合物裂解方式主要有糖苷鍵斷裂、RDA裂解重排、脫去中性碎片、丟失羰基、糖環裂解和交叉環切除等。典型化合物104在保留時間9.69 min時檢測到準分子離子峰m/z285.040 6[M-H]-，經質譜軟件和元素組成預測分子式C15H10O6，碎片離子有m/z257.047 3[M-H-CO]-、 239.032 4[M-H-CO-H2O]-、 211.041 0[M-H-2CO-H2O]-，同時母離子發生RDA裂解脫去C4H4O3和C8H6O2分子，得到碎片離子m/z185.057 7和151.034 2，與對照品和文獻[16]比對后推測為山柰酚，為君藥龍膽和臣藥梔子的共有成分，其質譜裂解途徑見圖2。

圖1 耳聾膠囊基峰色譜圖Fig.1 BPC chromatograms of Erlong Capsules

圖2 山柰酚質譜裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of kaempferol

3.2 萜類

3.2.1 環烯醚萜及其苷類 該類化合物裂解途徑主要為糖苷鍵斷裂及丟失CO2、H2O、CH3OH、CH3COOH等中性分子或母核上的一些取代基。典型化合物86在正離子模式下準分子離子峰為m/z357.117 6，推測其分子式C16H20O9，二級質譜可見碎片離子m/z195.064 9[M+H-Glu]+、177.054 0[M+H-Glu-H2O]+、149.059 4[M+H-Glu-H2O-CO]+，結合對照品、數據庫匹配和文獻[12]推測為龍膽苦苷，為君藥龍膽的《中國藥典》含量測定指標性成分，其質譜裂解途徑見圖3，保留時間7.94 min，準分子離子峰為m/z411.126 3[M+Na]+，推斷分子式C17H24O10，其質譜裂解途徑見圖4，結合對照品信息、文獻[13]和數據庫匹配推測為梔子苷，為臣藥梔子的《中國藥典》含量測定指標性成分。

表1 耳聾膠囊化學成分鑒定和藥材歸屬結果

續表1

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圖3 龍膽苦苷質譜裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of gentiopicroside

圖4 梔子苷質譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of geniposide

3.2.2 三萜及其苷類 該類化合物常丟失一分子或多分子糖基形成苷元離子，苷元離子則易失去一分子水，準分子離子可通過C-23和C-24之間重排得到碎片離子。典型化合物61準分子離子峰m/z515.372 6[M+H]+，保留時間為28.12 min，預測可能分子式C32H50O5，二級質譜中可見m/z497.363 5[M+H-H2O]+、 437.340 5[M+H-H2O-CH3COOH]+、383.292 1[M+H-H2O-C6H10O2]+、365.284 4[M+H-2H2O-C6H10O2]+，通過對照品比對、文獻[24-25]和數據庫匹配可以確定為23-乙酰澤瀉醇B，為組方藥材澤瀉的《中國藥典》含量測定指標性成分，其質譜裂解途徑見圖5。

圖5 23-乙酰澤瀉醇B質譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of Alisol-B 23-acetate

3.3 苯酞類 該類化合物裂解特征主要分為2類，一是側鏈斷裂脫烯，產生[M+H-CnH2n]+等碎片離子；另一類則表現為開環連續丟失H2O和CO分子。典型化合物38保留時間為15.35 min，準分子離子峰m/z191.106 9，推測分子式C12H14O2，二級裂解碎片可見m/z173.096 0[M+H-H2O]+、163.111 1[M+H-C2H4]+、149.059 5[M+H-C3H6]+、145.100 9[M+H-HCOOH]+、117.069 5[M+H-HCOOH-C2H4]+和105.070 1[M+H-HCOOH-C3H4]+，結合對照品信息、文獻報道[22]及數據庫匹配結果推測為Z-藁本內酯，為組方藥材當歸的主要活性成分之一，其質譜裂解途徑見圖6。

圖6 Z-藁本內酯質譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of Z-Ligustilide

3.4 香豆素類 該類化合物二級裂解特征主要為母離子丟失中性分子。典型化合物15保留時間為8.02 min，準分子離子峰m/z193.049 7[M+H]+，推測分子式C10H8O4，二級裂解可見碎片離子m/z165.055 4[M+H-CO]+、147.055 1[M+H-CO-H2O]+、137.059 0[M+H-2CO]+和119.049 0[M+H-2CO-H2O]+，結合文獻[9，15]和數據庫匹配結果推測為東莨菪內酯，為組方臣藥梔子的主要活性成分之一，其質譜裂解途徑見圖7。

圖7 東莨菪內酯質譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of Scopoletin

4 討論

中醫認為，中耳炎等耳部疾病與肝火上擾證密切相關；西醫認為，其發病機制主要為氧化損傷、炎性因子、微循環障礙、細胞凋亡、神經損傷和免疫反應等[37-39]。本研究較為全面地闡明了耳聾膠囊的化學成分，基本涵蓋了10味組方藥材，其中多數成分與耳部疾病發病機制有關。例如，在氧化損傷、抗炎和微循環調節方面，君藥龍膽中龍膽苦苷可降低腫瘤壞死因子-α、白介素-6、一氧化氮和丙二醛含量[40]；臣藥黃芩中黃芩苷、黃芩素對羥基自由基、超氧自由基和過氧自由基都具有一定的清除能力[41]；臣藥梔子中梔子苷和東莨菪內酯能夠顯著抑制體內外TNF-α、IL-6和白介素-1β的產生[42-43]；地黃中梓醇[44]和5-羥甲基糠醛[45]也具有一定的抗氧化損傷作用；澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B具有抗炎[46]作用；當歸中苯酞類如藁本內酯和黃酮類化合物具有較好的抗氧化和抗炎作用[47]；九節菖蒲中β-細辛醚可能通過抑制NF-κB轉錄與表達而起到抗炎作用[48]；甘草中甘草苷可以通過提高超氧化物歧化酶活性來減少自由基[49]，抗炎物質基礎主要為甘草酸、甘草次酸和甘草總黃酮[50]。在細胞凋亡方面，山柰酚可以抑制常見耳毒性藥物順鉑誘導的細胞凋亡[51]，地黃中梓醇可通過調節Bcl-2、Bax基因表達來抑制細胞凋亡[52]；在神經損傷方面，地黃中梓醇和毛蕊花糖苷被證實具有神經保護作用[53-55]；在免疫反應方面，地黃中(異)毛蕊花糖苷具有免疫調節的作用[56]。

綜上所述，UPLC-Q-TOF-MS /MS法可對耳聾膠囊化學成分進行檢測，而“對照品-數據庫-文獻報道”策略能有效提高鑒定準確性和可信度，為其后續藥效物質基礎、作用機制、質量控制研究提供參考。