天麻丸中獨活虛假投料及羌活劣藥投料的檢測

張 偉， 吳孟華

(1.廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160；2.暨南大學藥學院嶺南傳統中藥研究中心，廣東 廣州 511443)

天麻丸收載于2020年版《中國藥典》一部，處方含天麻60 g、羌活100 g、獨活50 g、鹽杜仲70 g、牛膝60 g、粉萆薢60 g、附子(黑順片)10 g、當歸100 g、地黃160 g、玄參60 g，劑型有水蜜丸、小蜜丸和大蜜丸，具有祛風除濕、通絡止痛、補益肝腎的功效，用于風濕瘀阻、肝腎不足所致的痹病，癥見肢體拘攣、手足麻木、腰腿痠痛。為控制天麻丸的質量，藥典采用了不同的方法，例如用顯微鑒別法檢測天麻、玄參、鹽杜仲、地黃、當歸、牛膝、粉萆薢，薄層鑒別法檢測天麻、羌活、當歸、牛膝，HPLC法測定羌活和獨活中天麻素、齊墩果酸含量。以異歐前胡素和蛇床子素的總量計，水蜜丸每1 g不得少于0.2 mg，小蜜丸每1 g不得少于0.13 mg，大蜜丸每丸不得少于1.2 mg[1]。

市售天麻丸價格參差不齊，部分存在中成藥價格與藥材成本倒掛的情況[2]。根據目前藥典質量控制方法，除附子(黑順片)外各組分均有定性或定量檢測指標[3-5]，基本能較好地控制天麻丸質量。然而，羌活、獨活、當歸均為來自傘形科藥材，以根入藥，前兩者主要含多種香豆素類成分，其中不乏同分異構體和結構相近者，容易相互干擾[6-8]。在藥典天麻丸含量測定項下，以乙腈-0.1%磷酸(58∶42)為流動相等度洗脫，以異歐前胡素表征羌活，蛇床子素表征獨活，結果以兩者總量計[1]，但能否將羌活與獨活中的數種香豆素類成分，尤其是同分異構體和結構相近者進行準確分離有待商榷。本研究采用HPLC法，結合單味飲片、陰性制劑、制劑的指紋圖譜，對來自20家企業的184批市售天麻丸進行檢測，該方法可對獨活虛假投料和不含羌活醇的劣等羌活投料進行判斷。

1 材料

Agilent1260液相色譜儀(美國Agilent公司)。異歐前胡素(批號110827-201109)、紫花前胡苷(批號111821-201102)、羌活醇(批號111820-201102)、蛇床子素(批號110822-201308)、藁本內酯(批號111737-201507)、二氫歐山芹醇當歸酸酯(批號111583-200301)對照品及羌活(批號120935-201408)、寬葉羌活(批號121405-200401)、獨活(批號120940-201111)、當歸(批號120927-201516)對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

10家企業提供9批羌活飲片、9批獨活飲片、10批當歸飲片用于制備陰性制劑，具體見表1。

表1 用于制備陰性制劑的飲片信息

天麻丸總計184批，來自20家企業，規格為水蜜丸、大蜜丸，具體見表2。

表2 天麻丸信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 藥典方法 Agilent SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸(58∶42)；柱溫45 ℃；檢測波長320 nm。理論塔板數按異歐前胡素峰計，應不低于20 000。

2.1.2 自擬方法 Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序見表3；體積流量1.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm。

表3 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

2.2.1 藥典方法 精密稱取異歐前胡素、蛇床子素對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含兩者10 μg的溶液，即得。

2.2.2 自擬方法 精密稱取紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、蛇床子素、藁本內酯對照品適量，甲醇制成每1 mL各含五者10 μg的溶液；精密稱取二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，甲醇制成每1 mL含10 μg該成分的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取水蜜丸適量，研碎，混勻，精密稱取1 g;取重量差異項下的大蜜丸，剪碎，混勻，精密稱取5 g，精密加入硅藻土5 g，研勻，精密稱取4 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，浸泡過夜，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性制劑制備 按2020年版《中國藥典》天麻丸項下制法(“以上十味，粉碎成細粉，過篩，混勻。每100 g粉末用煉蜜40～50 g加適量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加煉蜜90～110 g制成小蜜丸或大蜜丸”)，分別制備缺羌活、缺獨活、缺當歸的陰性制劑。

2.5 方法學考察 取樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰保留時間的重復性、精密度、穩定性(24 h)RSD均小于1.5%，峰面積三者RSD均小于4.1%，表明該方法精密度、重復性良好，溶液在24 h內穩定性理想。

2.6 圖譜分析

2.6.1 藥典方法 取184家企業32批大蜜丸、152批水蜜丸，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，蛇床子素于19.5 min左右出峰，異歐前胡素于20.5 min左右出峰，兩者分離度良好，但峰形均較矮胖，無法確定是否有未分離的其他色譜峰。

1.蛇床子素 2. 異歐前胡素1.osthole 2.isoimperatorin圖1 各成分HPLC色譜圖(藥典方法)Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents (pharmacopoeia method)

2.6.2 自擬方法

2.6.2.1 大蜜丸 分別取5家企業32批大蜜丸，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖2，指紋圖譜見圖3，再將圖譜數據導入“科邁恩(北京)科技有限公司Chempattern化學計量學系統軟件”[9-11]，計算相似度，結果見圖4。由此可知，除DFH的1批樣品相似度為0.57外，其余均大于0.9，可能是缺失羌活醇所致。

2.紫花前胡苷 10.藁本內酯 11.羌活醇 12.蛇床子素13.異歐前胡素2.nodakenin 10.ligustilide 11.notopterol 12.osthole 13.isoimperatorin圖2 大蜜丸中各成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents in big honeyed pills

2.6.2.2 水蜜丸 取17家企業152批水蜜丸，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖5，指紋圖譜見圖6，將圖譜數據導入“科邁恩(北京)科技有限公司Chempattern化學計量學系統軟件”[9-11]，計算相似度，結果見圖7。由此可知，水蜜丸分為2組，1組13個共有峰(A組)，另1組12個共有峰(B組)，A組以相似度0.8為界，高于0.8的為A1，低于0.8的為A2(主要為TSL樣品，可能是因為紫花前胡苷含量不穩定，變化較大所致)；B組為12個共有峰(相似度均低于0.8，主要集中在HBRH、XJTL-1、YJD、SCDQ、JHT、GZL、GZSJ、JLSS、TSL，可能缺失羌活醇)。同時，對LSZ、HBRH、XJTL-1、LSL樣品數大于10批的企業分別計算相似度，發現LSZ所有批次樣品相似度均大于0.95；HBRH有3批低于0.75，顯示為離群樣品，其余均大于0.95；XJTL-1有部分批次大于0.95；TSL有7批大于0.90，3批小于0.70，可能缺失羌活醇。

2.紫花前胡苷 10.藁本內酯 11.羌活醇 12.蛇床子素13.異歐前胡素2.nodakenin 10.ligustilide 11.notopterol 12.osthole 13.isoimperatorin圖5 水蜜丸中各成分HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of various constituents in water-honeyed pills

圖6 152批水蜜丸HPLC指紋圖譜Fig.6 HPLC fingerprints for one hundred and fifty-two batches of water-honeyed pills

圖7 152批水蜜丸相似度分布Fig.7 Similarity distribution for one hundred and fifty-two batches of water-honeyed pills

2.7 原料藥材歸屬 取羌活、獨活、當歸對照藥材及各飲片陰性制劑適量，按“2.3”項下方法制備相應溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，對保留時間一致、陰性制劑供試品溶液中未出現的色譜峰進行分析，再根據紫外光譜信息，對全方中與對照藥材指紋圖譜中的相關色譜峰進行歸屬。結果，天麻丸中有13個特征峰，峰1～2、11、13歸屬于羌活(2020年版《中國藥典》羌活藥材項下有2個基原，分別為羌活、寬葉羌活，在色譜圖中發現兩者相差較大，羌活醇、異歐前胡素為共有峰)，見圖8；峰3～7、12歸屬于獨活，見圖9；峰10歸屬于當歸，見圖10。以二氫歐山芹醇當歸酸酯為參照[12-13]，出峰時間為47.8 min左右，為獨活特征性成分之一，但在其陰性制劑中有干擾，故未作為特征峰進行考察。

2.紫花前胡苷 11.羌活醇 13.異歐前胡素2.nodakenin 11.notopterol 13. isoimperatorin圖8 各樣品HPLC指紋圖譜(Ⅰ)Fig.8 HPLC fingerprints for various samples (Ⅰ)

12.蛇床子素12.osthole圖9 各樣品HPLC指紋圖譜(Ⅱ)Fig.9 HPLC fingerprints for various samples (Ⅱ)

10.藁本內酯10.ligustilide圖10 各樣品HPLC指紋圖譜(Ⅲ)Fig.10 HPLC fingerprints for various samples (Ⅲ)

2.8 獨活虛假投料檢出 XJTL-2(批號13030003、13030004)、XJTL-1(批號141101)未檢出獨活特征峰及蛇床子素，見圖11，故判定未投料獨活。

注：A～D分別為XJTL-2(批號13030003)、XJTL-2(批號13030004)、XJTL-1(批號141101)、 LSZ。1.蛇床子素1. osthole圖11 獨活虛假投料、真實投料天麻丸HPLC指紋圖譜Fig.11 HPLC fingerprints for Tianma Pills fakely and truely fed with Angelicae pubescentis Radix

3 討論

3.1 檢測波長選擇 采用DAD檢測器在220、280、320、360 nm波長處測定，發現220、320 nm處的峰強度和數量較多，由于220 nm靠近紫外吸收末端，故在320 nm處檢測香豆素類(紫花前胡苷、蛇床子素、異歐前胡素)及藁本內酯類成分，結果均有較高的響應值，表觀強度較好，同時香豆素類成分穩定，基本不隨時間的變化而降解。

3.2 色譜柱選擇 天麻丸中香豆素較多，5 μm粒徑色譜柱分離度有限，故考察Agilent poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)、Phenomenex Kinetex C18(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)小粒徑色譜柱[14-15]，結果后者分離效果較好。

3.3 天麻丸生產投料問題 5家企業32批大蜜丸中，1家企業有1批相似度低，發現其不含羌活醇，但歸屬于羌活的1、2、13號峰均有出現；17家企業152批水蜜丸中，也有2個企業48批出現上述情況。根據以上制劑樣品的生產時間推測，購入羌活藥材時執行2010年版《中國藥典》，僅要求羌活中羌活醇和異歐前胡素總量不得少于0.40%，但2015、2020年版《中國藥典》新增特征圖譜，對羌活醇色譜峰的出現有明確要求，故此類不含羌活醇的羌活飲片不得再作為處方投料使用。羌活醇的穩定性欠佳，羌活長時間暴露在空氣中時其含量會有所降低，導致藥材質量下降[16]，無法滿足2015年版《中國藥典》要求。因此，建議企業在生產投料時不宜使用放置過久的該藥材。

17家企業152批水蜜丸中，有3批相似度小于0.8，發現其不含蛇床子素，同時歸屬于獨活的3、4、5、6、7、12號峰均缺失，判斷獨活均未投料，但如按2020年版《中國藥典》方法檢測，各項均符合規定。含量測定結果顯示，天麻丸[XJTL-2(批號13030003、13030004)]兩者總含量均為0.5 mg/g，XJTL-1(批號141101)天麻丸異歐前胡素和蛇床子素總含量為1.0 mg/g，均遠高于藥典“水蜜丸每1 g不得少于0.2 mg”的規定。因此，藥典方法檢測為合格的樣品若按照本研究自擬方法，可準確判斷獨活為虛假投料，系“合格的假藥”。

3.4 獨活虛假投料判斷 獨活具有祛風除濕、通痹止痛的功效，通常與羌活形成藥對在處方中使用[17]。羌活解表力佳，善治上半身痹痛，為止頭痛要藥[18]；獨活則解表力緩，善治下半身痹痛[19]，天麻丸中二藥合用，以行除全身之痹的功能。獨活虛假投料對天麻丸的功效影響很大，本研究所建立方法可很好地判斷是否如此。建議下一版《中國藥典》增加天麻丸特征圖譜，同時對化學結構類型相近、成分多樣化的藥材采用小粒徑色譜柱、多檢測器聯用等方式，增加特征性的指紋圖譜鑒別來杜絕虛假投料和劣藥投料，從而控制中成藥的質量。