補骨脂總黃酮提取工藝的優化

魯憲坤， 翟鑫源， 李方紅， 王 蕭， 張富坤， 張珊珊， 趙 盼， 趙東升*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

隨著機體的衰老，一些內源性抗氧化酶的活力逐漸降低，使得小分子活性氧自由基在體內蓄積過多，細胞膜中的不飽和脂肪酸被過多的活性氧自由基損害，引起脂質過氧化反應[1-2]，這類反應會對細胞器的結構和功能產生損害，并且引起細胞受損甚至死亡，導致心血管疾病、神經退行性疾病和癌癥等疾病[3-6]。為了降低脂質過氧化對機體造成的損傷，研發抗氧化劑已成為熱點，而中藥作為優良的天然抗氧化劑，正獲得了人們青睞。

補骨脂為豆科補骨脂屬植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，已廣泛應用于醫療、食品、化妝品等多個領域，具有多種生物作用，如抗氧化、抗菌、雌激素樣、抗抑郁、抗腫瘤、抗骨質疏松等[7-9]，主要含有黃酮、苯并呋喃、單萜酚、香豆素、擬雌內酯等活性成分[7-8,10]，現已從中分離出黃酮、二氫黃酮、異黃酮、查爾酮等五十余種黃酮[7-8]。目前，對補骨脂黃酮的研究大多為補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚等單一成分，或醇提黃酮的藥理活性或構-效關系[9,11-13]，鮮有涉及總黃酮提取工藝。

中藥所含成分復雜，僅憑借個別化合物含量高低來評價其提取工藝的優劣具有一定局限性，若能采用提取率與生物活性相整合的方法，則可更綜合全面地進行評價[14-16]。因此，本實驗在整合“成分-抗氧化活性”的模式下，以提取率、體外抗氧化活性為指標，采用雙響應面法優化補骨脂總黃酮提取工藝，以期為該成分的深入研發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 蘆丁對照品(純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度≥97%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。補骨脂(產地四川)購自安徽亳州中藥材批發市場，經山東中醫藥大學孫稚穎教授鑒定為豆科補骨脂屬植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實。亞硝酸鈉(分析純，中國醫藥集團上海化學試劑公司)；硝酸鋁(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；氫氧化鈉(分析純，天津市匯杭化工科技有限公司)；無水乙醇(分析純，天津富宇精細化工有限公司)。

1.2 儀器 X-5紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；KQ-500GVDV雙頻恒溫數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g藥材粉末，置于50 mL離心管中，超聲提取后13 000 r/min離心25 min，取上清液，即得。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 方法學考察

2.2.1.1 線性關系考察 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[17]，分別精密吸取0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加水至2.5 mL，加入0.4 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，反應6 min；0.4 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，反應6 min；6.0 mL 4%NaOH溶液，無水乙醇定容至刻度，搖勻，室溫靜置15 min，在510 nm波長處測定吸光度，平行3次，取平均值，以吸光度為縱坐標(A)，蘆丁質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=11.936X-0.003 4(r=0.999 2)，在0～0.05 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.1.2 精密度試驗 精密吸取0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液0.5 mL，按“2.2.1.1”項下方法測定吸光度6次，測得其RSD為1.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.3 穩定性試驗 取“2.1”項下供試品溶液0.2 mL，于0、2、4、8、24、48 h按“2.2.1.1”項下方法測定吸光度，測得其RSD為1.53%，表明溶液在48 h內穩定性良好。

2.2.1.4 重復性試驗 精密稱取0.5 g藥材粉末，平行6份，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1.1”項下方法測定吸光度，測得其RSD為0.74%，表明該方法重復性良好。

2.2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取總黃酮含量已知的藥材粉末0.5 g，平行12份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，其中3份為空白，其他9份每3份分別加入高、中、低質量濃度蘆丁對照品溶液，按“2.2.1.1”項下方法測定吸光度，計算回收率。結果，蘆丁平均加樣回收率為101.35%，RSD為1.13%。

2.3 單因素試驗 精密稱取0.5 g藥材粉末，分別設定乙醇體積分數為60%、70%、80%、90%、100%，液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，提取時間為20、30、40、50、60 min，提取功率為250、300、350、400、450 W。

2.3.1 乙醇體積分數 由圖1可知，乙醇體積分數在70%～90%范圍內時，總黃酮提取率明顯升高(P<0.05)，在90%時達到最大值，但在100%時略有降低；DPPH清除率隨乙醇體積分數的變化趨勢與總黃酮提取率呈現較好的一致性。因此，選擇80%～100%作進一步優化。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.2 液料比 由圖2可知，隨著液料比升高，總黃酮提取率、DPPH清除率均大體呈先升后降的趨勢，在40∶1時均達到最大值。因此，選擇30∶1～50∶1作進一步優化。

圖2 液料比對總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.3 提取溫度 由圖3可知，隨著提取溫度升高，總黃酮提取率、DPPH清除率均呈先升后降的趨勢，在30～50 ℃時兩者一致性良好；在50 ℃后DPPH清除率急劇下降，總黃酮與提取率一致性較差，這可能是由于過高的溫度在很大程度上破壞了具有體外抗氧化活性成分的結構，從而使其清除率顯著降低。因此，選擇30～50 ℃作進一步優化。

圖3 提取溫度對總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.4 提取時間 由圖4可知，提取時間對總黃酮提取率無明顯影響。從節約成本、DPPH清除率角度考慮，選擇30 min并不再作進一步優化。

圖4 提取時間對總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.5 提取功率 由圖5可知，提取功率對總黃酮提取率無明顯影響。從節約成本、DPPH清除率角度考慮，選擇350 W并不再作進一步優化。

圖5 提取功率對總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.4 Box-Behnken響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數(A)、液料比(B)、提取溫度(C)作為影響因素，總黃酮提取率(Y1)、DPPH清除率(Y2)作為評價指標，采用Design-Expert 8.0.6軟件安排試驗，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸和二項式分析，得方程分別為Y1=83.68+18.59A+2.60B+2.50C-0.177 5AB+1.40AC-0.355 0BC-17.72A2-1.69B2-0.755 3C2、Y2=34.71+0.277 5A+0.788 8B+0.251 2C+0.775 0AB-0.025 0AC-0.532 5BC-3.16A2-2.49B2-2.13C2，方差分析見表3～4。由此可知，2個模型顯著性均很強(P<0.01)，但失擬項均不顯著(P>0.05)，表明其擬合度較好[19]；Y1、Y2相關系數r分別為0.992 9、0.987 2，表明自變量分別可反映99.29%、98.72%響應值的變化[20]；以Y1為響應值時，因素A、B、C、A2具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，說明A對其影響不僅是簡單的線性關系[21]，而以Y2為響應值時，因素B、A2、B2、C2、AB、BC具有顯著性(P<0.05，P<0.01)；各因素對Y1的影響程度依次為A>B>C，對Y2的影響程度依次為B>A>C。

表3 總黃酮提取率方差分析

表4 DPPH清除率方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，見圖6～7。由此可知，乙醇體積分數與液料比、液料比與提取溫度對DPPH清除率的交互影響較顯著[22]；響應值均隨著自變量的變化先升后降，但在各因素最高、最低水平之間等高線稀疏，響應曲面較緩和，故其所對應兩因素之間的交互作用并不顯著，與方差分析結果一致。

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖6 各因素響應面圖(總黃酮提取率)

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖7 各因素響應面圖(DPPH清除率)

2.5 驗證試驗 采用Design-Expert 8.0.6軟件得到最優提取工藝為乙醇體積分數92.78%，液料比42.39∶1，提取溫度41.18 ℃，總黃酮提取率為88.31%，DPPH清除率為34.63%，結合實際操作，將其修正為乙醇體積分數93%，液料比42∶1，提取溫度41 ℃。按上述優化工藝進行3批驗證試驗，測得平均總黃酮提取率為(88.56±0.09)%，DPPH清除率為(34.52±0.15)%，與預測值88.31%、34.63%接近，表明該工藝穩定可行。

3 討論

鑒于“成分反映活性，活性指向功能”的中藥質量控制新模式，中藥提取工藝的研究不應僅以其所含成分提取率為唯一評價指標，還應綜合考慮其他相關因素，如活性、毒性等。同時，在中醫藥研究所需動物模型不完善的情況下，若采用活性成分提取率和體外活性整合的雙指標評價方法，則可更綜合全面地控制和優化中藥提取工藝。因此，本實驗以提取率與抗氧化活性為指標，通過雙響應面法優化補骨脂總黃酮提取工藝，所得最優工藝參數穩定可行，不僅有利于該成分作為天然抗氧化劑，在食品、藥品、化妝品、功能性食品、保健品等領域中的推廣應用，也為其他中藥提取工藝的研究提供了創新思路和方法。