趕黃草中大環多酚大孔樹脂純化工藝的優化

史鵬杰， 黃豆豆， 徐艾娜， 程嘉希， 董志穎， 孫連娜

(上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203)

趕黃草是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，主產于四川古藺，始載于明代《救荒本草》[1],其水提取物主要具備抗脂肪肝、抗肝纖維化及治療和保護肝損傷的作用[2]，還有一定解酒[3]、降糖[4]、緩解體力[5]、抗衰老[6]的作用。課題組前期研究結果表明，趕黃草中以黃酮苷連接沒食子酰基的酚酸類化合物pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose(PHG)、pinocembrin-7-O-[4″,6″-(S)-hexahydroxydiphenoyl-3″-galloyl]-β-D-glucose(PGHG)、thonningianin A具有較強的抗肝纖維化及保肝活性[7-9]，同時三者降糖活性較好[4]，開發前景廣闊。大孔樹脂作為環?？稍偕募兓盍?，具有性質穩定、成本低、樣品回收率高的特點[10-12]，故本實驗以大孔樹脂為填料，對趕黃草中大環多酚純化工藝進行優化，以期為進一步對該該成分的后續開發提供基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XS105DU、XS104電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Centrifuge5810R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendolf公司)；N-1300旋轉蒸發儀(日本東京理化器械株式會社)。

1.2 試劑與藥物 PHG(批號20181117)、thonningianin A(批號20181103)、PGHG(批號20181103)對照品均為自制，經HPLC歸一化法檢測其純度均≥98%。大孔樹脂AB-8、D-101、HPD-400(天津正天成澄清技術有限公司)；DM-130、HP-20、HPD-450、HPD-600、HPD-750、BS-30、ABS-21、DA-201(蚌埠市遼源新材料有限公司)；sepLite LX-17、sepLite LX-60、sepLite LX-3020、ztc-1、sepLite LX-12、sepLite XDA-8(西安藍曉科技新材料股份有限公司)。趕黃草由四川新荷花中藥飲片有限公司提供，批號19050701，經上海中醫藥大學孫連娜副教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜PenthorumchinensePursh.的干燥地上部分，保存于上海中醫藥大學中藥資源與生物技術研究中心。乙腈為色譜純(美國賽默飛公司)；甲酸為色譜純(上海麥克林生化科技有限公司)；乙醇、甲醇為分析純(德國Greagent公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 大環多酚含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取PHG、PGHG、thonningianin A對照品適量，80%甲醇制成質量濃度分別為0.600 8、0.598 4、0.499 2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材適量，80%甲醇溶解制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.5%甲酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，28%～30%A；10～20 min，30%～36%A；20～22 min，36%～39%A；22～30 min，39%～40%A；30～35 min，40%～90%A；35～37 min，90%～28%A；37～40 min，28%A)；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.PHG 2.PGHG 3.thonningianin A圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.4 線性關系考察 將“2.1.1”項下對照品溶液依次稀釋2、4、10、50、100倍，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得PHG、PGHG、thonningianin A方程分別為Y=19 108.510 7X-0.055 4(R2=1.000 0)，Y=22 849.421 6X-2.119 0(R2=1.000 0)，Y=23 226.107 9X+6.499 1(R2=1.000 0)，分別在6.01～600.80、5.98～598.40、4.99～499.20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 上樣液制備 根據課題組前期優化所得趕黃草中大環多酚的最優提取工藝提取藥材，具體方法為將藥材切成3～5 cm小段，10倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味(液體體積-藥材質量=4∶1)，向濃縮液中加入適量95%乙醇，調節體積分數至30%，4 000 r/min離心20 min，取上清液，即得。

2.3 靜態吸附性能考察 取預處理好的大孔樹脂抽濾，各精密稱取1 g，精密量取20 mL質量濃度為3.85 mg/mL的上樣液，在恒溫搖床上50 r/min、25 ℃振搖吸附24 h后抽濾，取濾液，測定大環多酚含量，去離子水清洗樹脂2次，抽濾至干，精密加入95%乙醇40 mL，在相同條件下振搖解吸24 h，取上清液，測定大環多酚含量，計算吸附率、解吸附率，公式如下，其中C0為上樣液中大環多酚初始質量濃度(mg/mL)，C1為吸附后上清液中大環多酚質量濃度(mg/mL)，C2為解吸后上清液中大環多酚質量濃度(mg/mL)，V1為上樣液體積(mL)，V2為解析溶液體積(mL)，W為樹脂質量(g)，結果見表1。綜合考慮吸附、解吸附效果，選擇HPD-400型大孔樹脂進行動態吸附性能考察。

2.4 吸附考察

表1 不同型號大孔樹脂吸附率、解吸附率測定結果

圖2 不同上樣質量濃度下吸附曲線

2.4.2徑高比對吸附效果的影響 取“2.3”項下上樣液，調節大環多酚總含量為1.89mg/mL，將其以3BV/h的體積流量通入裝有處理好的HPD-400型大孔樹脂、徑高比分別為1∶4、1∶8、1∶12的色譜柱中，填料質量(體積)分別為12g(20mL)、24g(40mL)、36g(60mL)。每1BV為1個流分，測定流出液中大環多酚總含量，計算泄漏點的吸附率[13]，吸附曲線見圖3。由此可知，隨著徑高比增加泄漏點提前，總吸附率呈降低趨勢，故選擇1∶4作進一步研究。

圖3 不同徑高比下吸附曲線

2.4.3上樣體積流量 取“2.3”項下上樣液，調節大環多酚總含量為1.89mg/mL，將其分別以1、2、3BV/h的體積流量通入裝有處理好的HPD-400型大孔樹脂、徑高比為1∶4的色譜柱中，填料質量(體積)為12g(20mL)，每1BV為1個流分，測定流出液中大環多酚總含量，計算泄漏點前吸附率，吸附曲線見圖4。由此可知，上樣體積流量較低時吸附率高，但耗時長，故結合生產實際選擇2～2.5BV/h作進一步研究。

圖4 不同體積流量下吸附曲線

2.4.4上樣量 取“2.2.3”項下上樣液，調節其大環多酚總含量為1.89mg/mL，將其以2～2.5BV/h的體積流量通入裝有處理好的12g(20mL)HPD-400型大孔樹脂、徑高比為1∶4的色譜柱中，每1BV為1個流分，測定流出液中大環多酚含量直至泄漏點，吸附曲線見圖5。由此可知，上樣量為10BV時流出液中大環多酚總含量為0.255mg/mL，已超過泄漏點，為減少樣品損失，故選擇9BV作進一步研究。

圖5 不同上樣量下吸附曲線

2.5 解吸附考察

2.5.1 洗脫液(乙醇)體積分數 平行裝柱(填料質量12 g，20 mL)，按“2.4”項下最優方式上樣(大環多酚含量為1.89 mg/mL)，依次加入體積分數為30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇各8 BV，以1.0～1.5 BV/h體積流量洗脫，計算洗脫液中大環多酚總量、洗脫部位質量、大環多酚含量，結果見表2。由此可知，大環多酚集中于40%～60%乙醇洗脫部位，含量在19.47%～35.43%之間。

表2 洗脫液體積分數考察結果

2.5.2 雜質洗脫體積分數 平行裝柱(填料質量12 g，20 mL)，按“2.4”項下最優方式上樣，分別用體積分數為30%、33%、37%、40%、43%的乙醇各8 BV洗脫除雜，收集洗脫液，減壓干燥后稱定質量，測定大環多酚含量，結果見圖6。由此可知，隨著乙醇體積分數增加，大環多酚損失率逐漸升高，為了在洗去較多雜質的同時減少損失，選擇雜質洗脫體積分數為40%。

圖6 雜質洗脫體積分數對大環多酚含量的影響

2.5.3 雜質洗脫液用量 平行裝柱(填料質量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優方式上樣，40%乙醇洗脫除雜，收集洗脫液，減壓干燥后稱定質量，結果見圖7。由此可知，雜質洗脫液用量為14 BV時親水性雜質基本被洗脫完全。

圖7 雜質洗脫曲線

2.5.4 洗脫劑(乙醇)體積分數 平行裝柱(填料質量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優方式上樣，14 BV40%乙醇洗脫除雜后分別用體積分數為45%、50%、55%、60%的乙醇各8 BV洗脫，收集洗脫液，檢測大環多酚含量，計算其轉移率，結果見圖8。由此可知，洗脫劑體積分數為50%時，大環多酚含量接近70%，轉移率高于50%；隨著洗脫劑體積分數進一步增加，轉移率升高，但含量明顯降低，故綜合考慮后確定為50%。

圖8 洗脫劑體積分數對大環多酚、轉移率的影響

2.5.5 洗脫劑(乙醇)用量 裝好大孔樹脂柱(填料質量96 g，160 mL)，按“2.4”項下最優方式上樣，以體積流量1.0～1.5 BV/h梯度洗脫，先用14 BV 40%乙醇洗脫除雜，再用50%乙醇洗脫，收集1～2、3～4、5～6、7～8、9～10 BV段，減壓濃縮至干，稱定質量，測定大環多酚含量，結果見圖9。由此可知，洗脫10 BV時基本可洗脫完全，故選擇其作為洗脫劑用量。

圖9 洗脫劑用量對大環多酚含量的影響

2.6 驗證試驗 稱取處理好的HPD-400型大孔樹脂2.4 kg(4 L)裝柱，調節上樣液中大環多酚質量濃度至1.60～2.20 mg/mL(溶液質量濃度約為20 mg/mL)，以2～2.5 BV/h體積流量通入徑高比為1∶4的HPD-400型大孔樹脂柱中，上樣量9 BV，以14 BV 40%、10 BV 50%乙醇依次洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，測定大環多酚含量、轉移率、得率，平行3批，結果見表3，可知該工藝穩定可靠。

3 討論

3.1 大孔樹脂選擇 大孔樹脂是一類具有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，性質穩定，是一類理想的純化填料。本實驗中考察了16種大孔樹脂，涵蓋了非極性、弱極性、中極性、極性、高表面活性5種不同性質的大孔樹脂，通過考察靜態吸附、解析附以及靜態吸附飽和時間，HPD-400型大孔樹脂具有較高的吸附率及最高的解吸附率，解吸附效果最佳，趕黃草中大環多酚屬極性中等偏大，與HPD-400型大孔樹脂性質一致，故選其為純化填料。

表3 驗證試驗結果(n=3)

3.2 上樣液制備 前期趕黃草藥材經提取后濃縮至無醇味，大環多酚在水中溶解度低，呈泥漿狀，隨溶媒乙醇體積分數升高溶解度增大。根據預實驗，該類成分在本實驗選擇型號大孔樹脂下，40%乙醇沖洗即可被洗脫，為了減少該類成分損失，選擇30%乙醇溶液作為溶媒。

3.3 結果分析 本實驗采用HPLC法測定PHG、PGHG、thonningianin A含量，并以其總含量在所得部位中的占比及其總轉移率為指標進行純化工藝考察。通過3次放大驗證此純化過程，大環多酚洗脫率可達90%，純化所得產品中大環多酚轉移率達50%以上，含量由上樣前的8%提高至65%以上，得率為6.56%，RSD均小于5%，說明該型號大孔樹脂較為適用于趕黃草中大環多酚成分的純化，且環?？芍貜屠茫杀镜?，為趕黃草中該類成分的進一步開發研究提供了有力支持。