基于網絡藥理學預測婦血康有機酸治療功能失調性子宮出血的機制

韋玥吟， 蔣怡萱， 黃盼玲， 吳超權， 李宇清， 夏 星*

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530000)

功能失調性子宮出血癥(dysfunctional uterine bleeding, DUB)在中醫屬于“崩漏”的范疇，即經血非時暴下或淋漓不止[1]，其基本病理生理特征為中樞神經系統下丘腦-垂體-卵巢軸神經內分泌調控異常，子宮肌層局部調節功能異常或為卵巢、子宮內膜不規則脫落[2]。壯藥婦血康以滇桂艾納香單獨成藥，有活血化瘀、止血調經功效[3]，其來源于菊科植物假東風草Blumeariparia(Bl.) DC 的干燥全草，《中華藥海》有“收斂止血，具有活血不傷血、止血不留瘀之功，可用于各種出血癥”的描述[4]，主要用于通火路龍路，用于發旺(風濕骨痛)、林得叮相(跌打腫痛)、兵淋勒(崩漏)、月經不調、狠尹(瘡)等癥[5]，臨床廣泛用于經血過多與產后惡露不止的治療，但是其藥效物質基礎和作用機制都尚未明晰。

研究表明，婦血康對產后出血的治療作用主要通過影響凝血、促進子宮收縮2條途徑產生[6]，介導其治療作用的藥效物質可能主要在于其水溶性提取部位，尤其是有機酸和多糖[7]。網絡藥理學可以反映化合物與靶點之間復雜的相互作用，預測藥物作用機制[8]。本研究從婦血康中有機酸的化學物質出發，通過網絡藥理學手段尋找到其作用于功能失調性子宮出血的靶點，分析可能的作用通路，并通過動物實驗進行初步驗證，為該壯藥臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1 婦血康有機酸部位化學成分數據庫構建及作用靶點篩選 利用中國知網、維普、Pubmed等數據庫，以婦血康的唯一原料滇桂艾納香、假東風草或其拉丁文名稱Blumeariparia(Bl.) DC.為檢索詞，檢索從滇桂艾納香中分離的主要有機酸類化合物；利用數據庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索滇桂艾納香有機酸化合物的2D、3D化學結構；利用數據庫PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，通過導入化合物3D化學結構獲取可能的藥效團模型靶點，此外利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索化合物的作用靶點，匯總PharmMapper及TCMSP的預測結果，構建婦血康有機酸化學成分作用靶點數據集。

1.1.2 DUB疾病-靶點的篩選 通過OMIM(https://omim.org/)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)等數據庫，以 “功能失調性子宮出血(dysfunctional uterine bleeding)、子宮出血(uterine bleeding)、子宮收縮(uterine contraction)、平滑肌收縮(smooth muscle contraction)”等為關鍵詞，建立疾病靶點集。

1.1.3 婦血康有機酸部位靶點-DUB疾病靶點網絡構建 為進一步了解婦血康有機酸成分與DUB疾病的直接作用關系，取“1.1.1”項下的藥物靶點及“1.1.2”項下疾病靶點交集，得到藥物-疾病交集靶點。將婦血康有機酸物質靶點與藥物-疾病交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。將藥物-DUB交集靶點導入String(version 11.0)數據庫，分析和預測婦血康有機酸部位-DUB的蛋白質-蛋白質相互作用，獲得蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network, PPI)。將從String數據庫中所獲取得到的相互作用關系網絡的tsv文本導入Cytoscape 3.7.2軟件中，對靶點進行拓撲屬性分析，尋找靶點間的相互作用關系，找出PPI網絡中起關鍵作用的靶點。

1.1.4 GO富集分析與KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Clue GO，對化合物調控網絡中的所有基因進行GO分析，并通過DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫進行KEGG功能注釋富集分析。通過GO分析找到靶蛋白可能發生的主要生物進程，通過KEGG分析找到靶蛋白可能參與的信號通路。

1.2 動物實驗驗證 課題組預實驗發現，婦血康有顯著促進DUB大鼠子宮收縮的效果。由于婦血康中絕大多數有機酸存在于其70%乙醇總提取物的乙酸乙酯萃取部位中[9]，且離體子宮收縮實驗是評價藥物對子宮收縮作用的經典方法[10]，因此，本研究進一步純化乙酸乙酯萃取部位，采用正常大鼠離體子宮，初步驗證婦血康的作用途徑。

1.2.1 動物 9周齡性成熟未孕雌性SD大鼠，SPF級，體質量220～250 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(桂)2014-0002。

1.2.2 試劑與藥物 婦血康有機酸成分段的制備：將滇桂艾納香生藥材粉碎后用70%乙醇浸提，濃縮后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對總提取物進行萃取，乙酸乙酯萃取部位用D101大孔樹脂吸附，依次用30%、50%、75%、95%乙醇洗脫，根據預實驗結果，取乙酸乙酯萃取部位的50%乙醇洗脫物用于驗證婦血康的作用靶點。經初步分析，該提取物中含有咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、沒食子酸、香草酸等有機酸成分。

戊酸雌二醇片(批號362A，拜爾醫藥保健有限公司廣州分公司)；硫酸阿托品(批號PS060，紹興民生醫藥股份有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(批號20180614，天津市大茂化學試劑廠)；水合氯醛、鹽酸利托君(批號B1826028、F1503113，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。其他試劑均為分析純。

1.2.3 儀器 BSA224S電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；CD-UPT-Ⅱ超純水制造系統(成都越純科技有限公司)；BL-420F生物機能實驗系統、HW-400E恒溫平滑肌槽(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2.4 含藥血清制備 取性成熟未受孕的雌性SD大鼠10只，隨機分為空白血清組、婦血康提取物組(40 mg/kg)，婦血康提取物的用藥劑量根據預實驗確定。婦血康提取物組大鼠每天灌胃給藥1次，連續7 d；空白血清組大鼠每天灌胃等量純水，末次灌胃給藥后腹主動脈取血，靜置后離心，取上層血清，即得空白血清、婦血康提取物含藥血清。

1.2.5 婦血康對大鼠離體子宮收縮的影響 實驗前3 d大鼠每天灌胃給予戊酸雌二醇(0.4 mg/只)，末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取子宮置于盛有洛氏液的培養皿中，固定于恒溫浴槽中，一端連接至張力換能器，設置溫度為37 ℃。待子宮收縮平穩后，向浴槽中分別加入空白血清、婦血康含藥血清，血清體積不斷疊加，檢測兩者對離體子宮平滑肌收縮的影響，以最大收縮力作為藥物作用的最大效應(Emax)。此外，分別利用M受體抑制劑硫酸阿托品(0.2 mol/L)、鈣離子螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na，0.075 3 mol/L)、β2受體抑制劑鹽酸利托君(0.002×10-3mol/L)作為工具藥，與婦血康含藥血清共同孵育，觀察子宮收縮Emax的變化，以驗證婦血康含藥血清的作用途徑。

2 結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1 成分篩選 通過檢索相關數據庫及文獻，找到滇桂艾納香(婦血康)有機酸組成主要為原兒茶酸、咖啡酸、丁香酸、沒食子酸、香草酸、呋喃甲酸、水楊酸、2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸、綠原酸，共檢索到2 225個潛在作用靶點，其中原兒茶酸有241個，咖啡酸有248個，丁香酸有246個，沒食子酸有252個，香草酸有238個，呋喃甲酸有176個，水楊酸有226個，2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸有299個，綠原酸有299個，去除重合靶點后，總靶點數為321個。

2.1.2 DUB疾病-靶點篩選 OMIM數據庫搜索得到624個DUB疾病相關靶點，Gene Cards搜索得到9 610個DUB疾病相關靶點，將2個數據庫靶點進行合并、去重，選取相關系數大于等于10者，整合得到DUB疾病相關靶點共1 673個。

2.1.3 有機酸靶點-DUB疾病靶點網絡構建 藥物-疾病交集靶點共79個，將其導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，見圖1。其中，節點(node)代表婦血康有機酸部位-DUB疾病存在交集的潛在作用靶點，邊(edge)代表婦血康與有機酸、婦血康有機酸成分與潛在靶點、DUB與潛在靶點之間的聯系。

圖1 有效成分-作用靶點網絡圖

將婦血康有機酸作用靶點-DUB疾病靶點的交集靶點導入String(version11.0)數據庫中，獲得蛋白互作關系網絡圖，見圖2，其中節點(node)代表蛋白，邊(edge)為節點之間的連線，表示相連的兩個蛋白之間具有相互作用。將從String數據庫中所獲取得到的相互作用關系網絡的tsv文本導入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用插件Network Analyzer對靶點進行拓撲屬性分析，結果見圖3。PPI網絡中共包含45個節點、220條邊，ALB、AKT1、MAPK1、SRC、CASP3、EGFR、HSP90AA1、MAPK8、MMP9、ESR1、MAP2K1、RHOA、PIK3R1等靶點可能在婦血康有機酸部位-功能失調性子宮出血網絡中具有重要意義。

圖2 藥物-疾病蛋白互作(PPI)網絡圖

圖3 拓撲屬性分析圖

2.1.4 GO功能分析、KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Clue GO，對中藥調控網絡中的所有基因進行GO功能分析，結果顯示，P<0.05的基因共108個，主要涉及類固醇激素受體活性、絲氨酸肽酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、有機酸結合、跨膜受體蛋白激酶活性、G蛋白偶聯受體結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-3-激酶結合等，見表1。通過DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫進行KEGG通路分析，共富集到P<0.05的婦血康有機酸部位作用靶點相關通路42條，包括VEGF信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路等，見表2。

表1 GO功能分析結果

2.2 動物實驗

2.2.1 工具藥對離體子宮收縮的影響 與空白平衡狀態下的離體子宮比較，阿托品、EDTA·2Na及利托君均能顯著抑制離體子宮的收縮，3種藥物的最大效應均低于空白平衡狀態(P<0.01)，見表3。

2.2.2 工具藥對婦血康含藥血清調節子宮收縮作用的影響 與空白血清組比較，婦血康含藥血清組離體子宮收縮力增強(P<0.01)；與婦血康含藥血清組比較，添加阿托品后子宮收縮下降至最大效應的0.67(P<0.01)，但子宮仍呈現弱的興奮狀態，與空白血清組比較，阿托品未出現抑制子宮收縮的作用(P>0.05)；與婦血康含藥血清組比較，婦血康含藥血清與EDTA·2Na共同孵育下的離體子宮收縮也被抑制(P<0.05)，而婦血康含藥血清與利托君共同孵育時，離體子宮收縮能力略有下降，但仍能達到最大效應的0.72，利托君松弛子宮的效應并不顯著(P>0.05)。見表4。

表2 KEGG通路富集分析結果

表3 工具藥對子宮收縮的影響

表4 工具藥對婦血康含藥血清調節子宮收縮作用的影響

3 討論

功能失調性子宮出血是由于下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO)功能失常，機體排卵功能受到抑制，從而使子宮內膜喪失對雌孕激素的周期性調節作用而導致的疾病[11]，與年齡、HPO軸、子宮血管結構功能異常[12]、纖維蛋白溶酶激活物質釋放增多有關[13]。目前以壯藥滇桂艾納香為單味成藥的婦血康顆粒，已廣泛用于DUB的治療上，但其作用機制的研究較少。

現有研究表明，婦血康顆粒有效成分滇桂艾納香的有機酸和多糖類物質，可能是其發揮凝血和促子宮收縮作用的主要藥效物質[7]。本研究通過網絡藥理學預測婦血康有機酸對DUB的作用靶點，發現它們可能是其治療DUB的藥效物質，這與Huang等[7]報道是一致的。另外，有機酸類分布的婦血康活性段含藥血清在體外有促進大鼠離體子宮收縮的效果。

調節子宮平滑肌的收縮狀態可能是婦血康治療DUB的的主要作用途徑[6]。本研究通過GO富集分析和KEGG通路分析發現，婦血康有機酸成分在DUB疾病中對G蛋白偶聯受體有直接的作用，并且該受體下游的cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路顯著度排名均靠前。β腎上腺素受體正是一種G蛋白偶聯受體[14]，子宮平滑肌的β腎上腺素受體興奮程度決定著子宮的收縮能力。本研究利用作用于不同受體的工具藥，在離體子宮實驗中驗證了婦血康通過β腎上腺素受體對子宮收縮的影響，發現分別將M受體阻斷劑阿托品、Ca2+螯合劑EDTA·2Na與婦血康活性段聯合使用時，對其促進子宮收縮影響并不顯著，但當婦血康與β2受體激動劑利托君共同使用時，利托君松弛子宮平滑肌的作用受到顯著抑制，提示婦血康可能是通過阻斷β腎上腺素受體從而影響子宮收縮，這驗證了在網絡藥理學研究部分的G蛋白偶聯受體參與婦血康有機酸成分治療DUB的預測。此外，那襲雪等[15]研究了滇桂艾納香的同科屬近緣種植物白花九里明治療產后出血的作用機制，發現其中的咖啡酸等有機酸物質能顯著興奮小鼠離體子宮平滑肌，并認為其可能是通過影響非選擇性β受體發揮作用，這與本研究結果相吻合。

網絡藥理學結果發現，G蛋白偶聯受體、cAMP信號通路及PI3K-Akt信號通路中的關鍵位點包括PRKACA、GPCR、RhoA、ROCK、Raf1、PI3K、Rac1、Akt等。抑制肌球蛋白輕鏈(myosinlight chain, MLC)活性可誘導平滑肌細胞發生鈣增敏效應，使得閾值水平[Ca2+]i能引起平滑肌超閾值水平收縮。小分子G蛋白Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A, RhoA)在平滑肌收縮過程中的靶標是Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)，受外界刺激時，游離于胞漿中的RhoA活化并向細胞膜聚集與膜結合，將信號傳給ROCK，使分子中854位絲氨酸和697位蘇氨酸磷酸化而激活，再將其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)磷酸化使之失活，失活的MLCP不能使MLC脫磷酸化，胞漿內MLC磷酸化水平上升，導致平滑肌收縮[16]。激活β2受體可興奮G蛋白偶聯受體，使腺苷酸環化酶(adenylate cyclase, AC)活化，催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生成環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)[17-19]，當細胞內的cAMP到達一定水平時，可激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)[20]，PKA發生磷酸化抑制RhoA水平，導致ROCK表達降低，ROCK磷酸化水平降低使蛋白磷酸酶1調節亞基12A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A, MYPT1)水平生高，磷酸化MYPT1抑制MLC水平，使肌球蛋白ATP酶活性降低，最終導致平滑肌舒張，這一調控通路上的多個位點均顯示與婦血康有機酸成分高度相關。

綜上所述，婦血康作為在壯醫藥理論指導下開發的壯藥，能通過調節子宮平滑肌的收縮能力對功能失調性子宮出血發揮治療作用，網絡藥理學結合動物實驗驗證結果提示，它可能是通過影響大鼠子宮平滑肌中的β2受體或(及)其所在通路從而發揮促進子宮收縮的作用，具體還有待進一步研究。