高濃度CO2對2株生防真菌生長與致病力的影響

王從林，刁紅亮，邢培翔，王 迪，王志鑫，馬瑞燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山西 太谷 030801）

工業(yè)革命之后，全球大氣中的CO2濃度一直處于上升狀態(tài)，目前大氣CO2濃度已達(dá)到400 μmol/mol，預(yù)計(jì)2100 年將上升至730～1 020 μmol/mol。升高的CO2濃度除了對全球氣候的變化產(chǎn)生重大影響之外，還對各種植物、昆蟲以及微生物的生長和活動等都有不同程度的影響[1-2]。環(huán)境中CO2濃度的增加可加大植物分支和分蘗的機(jī)會以及促進(jìn)根系和幼苗的生長，促進(jìn)水分的利用，加快植物自身循環(huán)代謝積累和生長，提高植物的抗逆境和光合等作用[3]。與此同時，發(fā)展富碳農(nóng)業(yè)也逐漸成為各國應(yīng)對氣候變化和糧食安全的重要舉措。富碳農(nóng)業(yè)是以高于大氣中二氧化碳濃度作為氣肥釋放在相對密閉的人造氣候的小區(qū)域中，培養(yǎng)種植各類作物，輔以其他科學(xué)技術(shù)手段，創(chuàng)造一個高效率的光合作用環(huán)境，生產(chǎn)出大量農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的一類農(nóng)業(yè)生產(chǎn)新技術(shù)[4]，其中以富碳溫室的應(yīng)用最為普遍。富碳溫室的出現(xiàn)解決了作物光合作用活動加強(qiáng)時CO2濃度降低引起的CO“2饑餓癥”，進(jìn)而影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的問題。有研究表明，在黃瓜棚中適量增加CO2濃度后，平均葉寬和葉長會增加1.0～1.3 cm，平均株高、平均莖圍以及平均掛果數(shù)都有顯著增加，增施CO2也可促進(jìn)作物提前成熟，改善蔬菜品質(zhì)，使作物根系更發(fā)達(dá)等[5]。趙靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度CO2加快了草莓果實(shí)的生長，提高了產(chǎn)量，改善了果實(shí)品質(zhì)。因此，對C3植物來說，CO2濃度升高具有顯著的“CO2施肥效應(yīng)”，而現(xiàn)有CO2條件下其光合速率受到限制，其最適CO2濃度約為1 000 μmol/mol[7]。

另一方面，CO2濃度升高也會對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一些負(fù)面影響[8]。王璐等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高使甜椒光合作用和水分利用率升高，促進(jìn)了其生長發(fā)育，但同時也使甜椒蚜蟲數(shù)總量顯著增加97.30%，整體蟲害發(fā)生加劇，導(dǎo)致其產(chǎn)量及地上部生物量無顯著變化。因此，關(guān)注富碳環(huán)境下病蟲害的安全高效治理是保障富碳農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要舉措。昆蟲病原真菌可與節(jié)肢動物形成一種有利于自身但有害于寄主的共生關(guān)系，是一種寄生性真菌，其中一些可用于蟲害防治的又被稱作生防真菌[10]。生防真菌在昆蟲綱（Insecta）和蜱螨目（Acarina）中具有較廣的寄主范圍和顯著的應(yīng)用特點(diǎn)，是目前唯一可高效防治半翅目刺吸式口器害蟲的生防資源[11]。以蟲生真菌為活性物的真菌殺蟲劑已被廣泛應(yīng)用于溫室、大田和園林中的薊馬、白粉虱、蚜蟲等主要害蟲的防治[12]，是一種安全高效的生物防治技術(shù)。玉米粘蟲（Mythimna separateWalker），又名東方粘蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），喜食稻、麥、粟、黍、玉米、高粱等作物，是嚴(yán)重威脅我國糧食生產(chǎn)安全的重大蟲害[13]。溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）屬同翅目（Homoptera）粉虱科（Aleyrodidae），繁殖力強(qiáng)，食性雜，是溫室蔬菜的主要害蟲之一[14]。

本試驗(yàn)以2 株重要的生防真菌玫煙色棒束孢（Isaria fumosoroseaWize）和白僵菌（Beauveria bassianaVuill）為對象，研究了富碳條件對菌株孢子萌發(fā)能力和對玉米粘蟲和白粉虱2 種寄主害蟲致病力的影響，并進(jìn)一步研究了高濃度CO2條件對2 個菌株萌發(fā)與生長的影響，旨在為富碳溫室中應(yīng)用生防真菌防治蟲害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢IF-1106 菌株（簡稱IF-1106），分離自山西省晉中市太谷縣普通溫室大棚中，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.7514。

白僵菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號為CICC 41021（簡稱BB-1021），為凍干菌種，經(jīng)打管活化后再轉(zhuǎn)接2～3 代恢復(fù)菌種活力后使用。

1.1.2 供試?yán)ハx 溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorumWestwood）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)種群，飼養(yǎng)與繁殖條件為溫度為（26±1）℃，濕度65%±5%，光照L∶D＝14∶10。

玉米粘蟲（Mythimna separateWalker）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)種群，飼養(yǎng)與繁殖條件為溫度（25±1）℃，濕度60%～80%，光照L∶D＝12∶12。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防真菌孢子懸浮液的配制 將2 株生防菌株接種于PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃、12∶12（L∶D），培養(yǎng)10 d產(chǎn)孢。將一定量0.1%吐溫-80無菌水加入到長滿菌絲的培養(yǎng)皿中，用刮板輕輕將孢子和菌絲刮下，將孢子混合液轉(zhuǎn)移至盛有玻璃珠的錐形瓶中，將孢子均勻打散，用滅菌紗布過濾得到母液。先用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整母液至孢子濃度為1.0×108個/mL，再將其稀釋相應(yīng)濃度。

1.2.2 生防真菌孢子萌發(fā)率的測定 采用改進(jìn)后COHEN 等[15]的CFU 孢子萌發(fā)率方法測定菌株的孢子萌發(fā)率。使用無菌移液器吸取200 μL配制好的孢子懸浮液（濃度為1.5×103個/mL）置于直徑為150 mm PDA平板中（每皿約含300個孢子），以無菌涂布器涂布均勻。將接種后的平板分別置于25 ℃的普通霉菌培養(yǎng)箱和富含CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48～72 h直至生長出清晰菌落，使用菌落計(jì)數(shù)器確定平板中的菌落數(shù)，并計(jì)算孢子萌發(fā)率。富碳條件的CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000 mg/kg（0.1%），高體積分?jǐn)?shù)CO2條件分別設(shè)定為5%、10%、15%和20%，普通條件下CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為400 mg/kg（0.04%）為對照，每個處理設(shè)5個重復(fù)。

1.2.3 生防真菌生長速率的測定 首先將直徑6 mm 的滅菌濾紙片置于PDA 平板中央，以無菌移液器吸取2.5 μL 孢子懸浮液（1.0×107個/mL）輕輕接種在濾紙片上，將接種后的平板置于25 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h 后取出平板采用十字交叉法測定菌落直徑，連續(xù)測定10 d。

1.2.4 生防真菌致病力測定 分別配制3 個濃度的孢子懸浮液（1.0×106、1.0×107和1.0×108個/mL），對玉米粘蟲3齡幼蟲進(jìn)行浸漬感染。浸漬20 s后放入培養(yǎng)皿中并用保鮮膜封口，在薄膜上扎小孔通氣，置于25 ℃、12 L∶12 D、相對濕度80%以上CO2人工氣候箱培養(yǎng)。每天更換新鮮玉米葉，每日檢查死亡蟲數(shù)，根據(jù)蟲尸體表長出的真菌孢子確定為感染致死，連續(xù)觀察7 d。每個處理設(shè)6 個重復(fù)，每個重復(fù)15頭試蟲，以0.01%吐溫-80的無菌水處理作為空白對照。

用同上所述的3 個濃度的孢子懸浮液對帶有白粉虱2齡若蟲的黃瓜葉片進(jìn)行噴霧侵染，直至葉片上形成液滴并自然滴下，用0.1%的吐溫-80 無菌水處理作為對照。每處理設(shè)6個重復(fù)，每個重復(fù)中含2齡若蟲50頭。待黃瓜葉片自然晾干后，將幼苗置于25 ℃、14 L∶10 D、相對濕度80%以上的CO2人工氣候箱中，在富碳條件（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 000 mg/kg）和普通條件（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)400 mg/kg）下培養(yǎng)，并逐日觀察記錄白粉虱致死情況，連續(xù)觀察7 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對生防真菌的萌發(fā)與生長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，萌發(fā)率通過Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。回歸方程用SPSS 19.0 線性回歸分析得出，回歸方程斜率即為菌落生長速率。

生防真菌在不同CO2條件下對試蟲的累計(jì)校正死亡率采用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。生防菌株的致病力數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 富碳條件對2株生防真菌萌發(fā)率的影響

2株生防真菌在富碳條件與普通條件下的萌發(fā)率對比結(jié)果如圖1 所示。從圖1 可以看出，生防菌株IF-1106 在富碳條件與普通條件下的孢子萌發(fā)率（F＝0.079；df＝1，8；P＝0.785）差異不顯著；而生防菌株BB-1021 在富碳條件與普通條件下的孢子萌發(fā)率（F＝0.087；df＝1，8；P＝0.776）同樣差異不顯著。表明富碳溫室中的高CO2濃度環(huán)境對2株生防真菌的萌發(fā)沒有影響。

2.2 高體積分?jǐn)?shù)CO2對2株生防真菌萌發(fā)率的影響

在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%時，2株菌株的萌發(fā)率分別如圖2、3 所示。由圖2 可知，在不同體積分?jǐn)?shù)CO2條件下，IF-1106 孢子萌發(fā)率存在顯著差異（F＝94.050；df＝4，24；P＜0.001），其中當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時，菌株的萌發(fā)率最高，為96.68%±3.29%，且與對照差異不顯著（P＝0.964）；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和15%時，孢子萌發(fā)率分別為69.08%±3.11%和65.44%±1.64%；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時，孢子萌發(fā)率最低，為19.48%±3.44%。結(jié)果表明，在CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時，IF1106 菌株孢子的萌發(fā)無抑制作用。

由圖3 可知，不同濃度CO2對BB-1021 的孢子萌發(fā)率也存在顯著的差異（F＝120.64；df＝4，24；P＜0.001）。其中，當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時，孢子萌發(fā)率均為100%，且顯著高于對照（P＝0.015；P＝0.040）；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為15%和20%時，菌株的萌發(fā)率分別為79.73%±2.02%和61.60%±2.09%，且顯著低于對照（P＜0.05）。表明CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和10%對BB-1021 菌株孢子的萌發(fā)無抑制作用。

2.3 高體積分?jǐn)?shù)CO2對2株生防菌株生長的影響

在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%時，2個菌株菌落的生長擬合曲線分別如圖4、5所示，其生長速率回歸方程及其參數(shù)如表1、2所示。從圖4和表1可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)CO2條件對IF-1106菌株菌落的生長有一定影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%時，對2 個菌株菌落的生長具有一定促進(jìn)作用，其中CO2體積分?jǐn)?shù)為10%時，菌株的生長速率顯著最大（P＜0.05），達(dá)到3.019 mm/d；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和15%時，菌株的生長速率較對照差異不顯著；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時，2個菌株菌落的生長速率為2.505 mm/d，顯著低于對照（P＜0.05）。

表1 玫煙色棒束孢的生IF-長1速10率6在回不歸同方體程積分?jǐn)?shù)CO2條件下Tab.1 Growth rate regression equation of Isaria fumosorosea IF-1106 at different CO2 concentrations

從圖5 和表2 可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)CO2對BB-1021菌株菌落的生長也有一定影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和15%時，對菌落的生長具有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），其中CO2體積分?jǐn)?shù)為5%時菌株的生長速率最大，達(dá)到（3.398±0.055）mm/d；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時，菌落的生長速率為（2.359±0.0317）mm/d，顯著低于對照。

表2 白僵菌BB生-長10速21率在回不歸同方濃程度CO2條件下的Tab.2 Growth rate regression equation of Beauveria bassiana BB-1021 at different CO2 concentrations

2.4 富碳條件對2株生防真菌致病力的影響

2.4.1 富碳條件對2株生防真菌感染玉米粘蟲3齡幼蟲致病力的影響 在普通環(huán)境（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)400 mg/kg）和富碳環(huán)境（CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 000 mg/kg）中，用不同濃度的孢子懸浮液處理玉米粘蟲3齡幼蟲，7 d后的累計(jì)校正死亡率如圖6所示。

從圖6 可以看出，在2 種CO2濃度條件下，IF-1106菌株1.0×107個/mL和1.0×108個/mL這2個濃度孢子懸浮液對玉米粘蟲3 齡幼蟲的感染死亡率與對照存在顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)濃度為1.0×106個/mL 時，2 種CO2條件下的校正死亡率差異不顯著（F＝0.078；df＝1，8；P＝0.788）；當(dāng)濃度為1.0×107個/mL 和1.0×108個/mL 時2 種CO2條件下的校正死亡率差異顯著（（F＝16.010；df＝1，8；P＝0.004），（F＝10.021；df＝1，8；P＝0.013）），且富碳環(huán)境下IF-1106菌株對粘蟲3齡幼蟲的感染致死能力顯著高于普通環(huán)境。

BB-1021菌株在濃度為1.0×106個/mL時，2種CO2濃度條件下的校正死亡率差異顯著（F＝28.048；df＝1，8；P＝0.001）；當(dāng)濃度1.0×107個/mL 和1.0×108個/mL時，校正死亡率差異均不顯著（（F＝2.208；df＝1，8；P＝0.176）；（F＝0.186；df＝1，8；P＝0.677））。在富碳環(huán)境下BB-1021菌株1.0×106個/mL濃度感染致死能力顯著高于普通環(huán)境。

2.4.2 富碳條件對2 株生防真菌感染溫室白粉虱2 齡若蟲致病力的影響 用不同濃度的IF-1106和BB-1021 分別在普通環(huán)境和富碳環(huán)境中感染溫室白粉虱2 齡若蟲，7 d 后累計(jì)校正死亡率如圖7所示。

從圖7 可以看出，2 種CO2濃度條件下IF-1106孢子懸浮液對白粉虱2 齡若蟲的感染死亡率差異均不顯著（（F＝0.002；df＝1，8；P＝0.965）；（F＝3.821；df＝1，8；P＝0.086）；（F＝0.094；df＝1，8；P＝0.768））。

BB-1021 菌株各個濃度孢子懸浮液對白粉虱2 齡若蟲的感染死亡率差異均不顯著（（F＝0.051；df＝1，8；P＝0.827）；（F＝0.899；df＝1，8；P＝0.371）；（F＝1.355；df＝1，8；P＝0.278））。

3 結(jié)論與討論

近年來，CO2濃度升高對微生物群落和生長的影響已成為研究熱點(diǎn)，但多集中于對土壤微生物的研究，鮮有涉及昆蟲病原真菌。一般認(rèn)為，CO2濃度升高促進(jìn)了碳輸入，對真菌的生長更為有利[16]，例如土壤功能微生物叢枝菌根真菌豐富度在CO2濃度升高下平均增加了21%[17]。本研究結(jié)果顯示，CO2濃度提高到富碳溫室水平時，生防真菌玫煙色棒束孢IF-1106 和白僵菌BB-1021 的孢子萌發(fā)沒有受到影響，可以保持正常的萌發(fā)率。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)提高至10%時，玫煙色棒束孢IF-1106孢子萌發(fā)無顯著影響并且菌絲生長速率明顯提高；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%時，白僵菌BB-1021 孢子萌發(fā)無顯著影響且菌絲生長速率顯著增加。結(jié)果表明，一定體積分?jǐn)?shù)的CO2可在不影響孢子萌發(fā)的前提下促進(jìn)菌株的菌落生長，這種響應(yīng)特點(diǎn)應(yīng)該與菌株生長萌發(fā)的需氧量特性有關(guān)，例如，玫煙色棒束孢屬于發(fā)酵培養(yǎng)需氧量較低的蟲生真菌[18]，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。而過高的CO2濃度開始影響到菌株的正常呼吸作用，因此，當(dāng)試驗(yàn)中CO2體積分?jǐn)?shù)≥15%時，菌株的萌發(fā)生長被明顯抑制。

玫煙色棒束孢和白僵菌可有效感染溫室白粉虱。孟豪[19]測定了玫煙色棒束孢和白僵菌對溫室白粉虱2齡若蟲的致病力，其LC50值分別為1.58×105、3.57×106個/mL。NAEEM 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，玫煙色棒束孢和白僵菌也可有效感染玉米粘蟲，對玉米粘蟲3齡幼蟲的LC50值分別為3.19×108、6.48×108個/mL。提高CO2的濃度對昆蟲和微生物都會產(chǎn)生一定影響，因此，在富碳條件下生防真菌的致病力可能是交互作用影響的結(jié)果。林春燕等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度CO2對II 型豌豆蚜產(chǎn)蚜前歷期無明顯影響，但能顯著抑制其繁殖力。CO2濃度的升高會引起自然界各個組分的改變，使昆蟲的生存環(huán)境和競爭者發(fā)生改變，從而間接影響昆蟲生長發(fā)育的過程以及生活習(xí)性[22-23]。趙磊[24]研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高對亞洲玉米螟的生長發(fā)育、取食效應(yīng)、種群特性都產(chǎn)生了顯著影響。本研究對比了富碳條件與普通條件下生防真菌玫煙色棒束孢和白僵菌對2 種害蟲的致死率，結(jié)果顯示，富碳條件對2株生防真菌感染2種害蟲的致死率無顯著影響并具有一定促進(jìn)作用，這表明在富碳條件下可以使用這2 株生防真菌作為害蟲防治因子。

本研究表明，富碳溫室中的高CO2濃度環(huán)境對生防真菌玫煙色棒束孢和白僵菌的萌發(fā)沒有影響，同時也對菌株侵染玉米粘蟲和溫室白粉虱的致病力沒有顯著影響。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)小于10%時，白僵菌孢子的萌發(fā)不受到抑制，玫煙色棒束孢孢子的萌發(fā)受到輕微抑制；當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)大于10%時，對2株菌株的孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，表明10%的CO2體積分?jǐn)?shù)可能是2株病原真菌孢子萌發(fā)的臨界值。同時，白僵菌較玫煙色蟲草對高體積分?jǐn)?shù)的CO2表現(xiàn)出更高的耐受性。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為20%時，3株生防真菌的菌絲生長均受到了抑制，表明15%～20%的CO2體積分?jǐn)?shù)可能是2株真菌菌絲生長的臨界值。張鑫等[25]研究表明，高濃度CO2會降低黏蟲體內(nèi)甘油三脂含量及體質(zhì)量，使水分含量增大，這有利于昆蟲病原真菌在侵染寄主時，需要一定的濕度，在寄主體內(nèi)需要吸收寄主營養(yǎng)和水分，來滿足自身的生長。因此，高體積分?jǐn)?shù)CO2對真菌的生長提供了更加合適的環(huán)境，粘蟲的死亡率相應(yīng)增加。本研究表明，富碳溫室的高濃度CO2環(huán)境不影響2株生防真菌的萌發(fā)，支持了以生防真菌作為富碳溫室的生防因子防治溫室蟲害的可行性，且進(jìn)一步明確了一定的高濃度CO2條件可在不影響孢子萌發(fā)的前提下有效促進(jìn)生防真菌的生長。