基于網絡藥理學和分子對接探討通關藤治療胃癌的作用機制

覃 薇, 殷梓辛, 華維維, 王玉潔, 王 楊,鄧嘉林, 蔡曌穎, 錢亞云, 2

(1. 揚州大學轉化醫學院, 江蘇 揚州, 225001;2. 國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室, 江蘇 揚州, 225001)

胃癌(GC)[1]為全球發病率最高的消化道惡性腫瘤之一，早期癥狀難以察覺，多數患者確診時已發現轉移病灶甚至進展為晚期。胃癌的治療主要依賴化療和放療，但腫瘤細胞的耐藥性以及化療的毒副作用會嚴重影響治療效果，降低患者生活質量[2]?，F代藥理學研究[3-4]表明，中藥聯合用藥治療腫瘤可提高放化療的有效性，減輕副作用，調節免疫力，很大程度上提高腫瘤患者生存質量。通關藤[Marsdeniatenacissima(Roxb.)Wight et Arn.,MT]又稱烏骨藤，主要產于中國云南省，味苦，微寒，歸肺經，具有止咳平喘、祛痰、清熱解毒的功效[5]?，F代中藥研究[6]中, MT被證實具有抗癌、平喘、抑菌、保肝、利尿及免疫調節的作用，其制劑消癌平注射液已被廣泛應用于臨床，并取得良好治療效果。本研究探討MT的具體抗癌活性物質及分子作用機制，以期更好地指導臨床用藥。

1 資料與方法

1.1 MT的活性成分與靶點篩選

在Pubmed、知網數據庫等中英文檢索平臺輸入關鍵詞“通關藤” “烏骨藤”“Marsdeniatenacissima”, 獲取通關藤相關活性成分，并通過Chemical Book、化學專業數據庫、化源網分別對活性成分相關信息、化合物結構、CAS號進行補充及篩選，用PubChem確認活性成分的結構及名稱，得到通關藤候選活性成分。Swiss ADME中，化合物符合Lipinski[21]、Ghose[22]、Veber[23]、Egan[24]、Muegge[25]中2種及以上的類藥性原則，則被視為具有較好的成藥潛力; 腸胃吸收(gatrointestinal absortion, GI absortion) 結果為“High”[26], 則表示該化合物具有較好的口服生物利用度。以同時具有較好成藥潛力及口服生物利用度為標準[27], 篩選出MT有效活性成分。將MT有效活性成分SMILES格式文件分別導入Swiss Target Prediction數據庫，每個活性成分取前100個“probability”值大于0的潛在作用靶點，匯總后得到MT活性成分靶點，使用Uniprot數據庫統一規范為基因名。資料收集與處理使用的網站及數據庫見表1。

表1 網站及數據庫匯總

1.2 GC相關靶點搜集及共同靶點獲取

在DrugBank、OMIM、TTD、GeneCards等數據庫檢索關鍵詞“gastric cancer”, 得到GC相關靶點，并采用Uniprot規范為基因名。將MT與GC基因名取交集后得到交集基因，由Cytoscape構建可視化“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及核心基因篩選

將交集基因導入String，以Interaction score>0.9篩選交集基因，并剔除游離基因，得到關鍵基因，作PPI網絡，導出為tsv(*. tsv)文件并使用Cytoscape打開，構建可視化網絡圖，使用MCC算法篩選前10個核心基因(Hub Gene)。

1.4 分子對接

為了驗證Hub Gene，本研究通過分子對接技術來探討活性成分與基因蛋白的相互結合作用。MT關鍵成分中, Kaempferol及Caffeic acid已有大量抗腫瘤的實驗研究基礎，因此，選擇Kaempferol及Caffeic acid分別與9個Hub Gene小分子蛋白(其中RHOA未檢索到其pdb格式文件，不予納入)進行分子對接。對接蛋白核心結構的pdb文件格式(*. pdb)下載于RCSB PDB數據庫: SRC[1CSK(PDB ID，下同)]、PIK3CA(6GVF)、PIK3R1(3HHM)、EGFR(3IKA)、ERBB2(2A91)、VEGFA(6T9D)、GRB2(1JYU)、PTK2(6I8Z)、10HSP90AA1(5NJX); 使用PyMOL對蛋白進行去水、去除有機物等處理。在ZINC平臺下載活性化合物MOL2格式文件，PyMOL轉換為pdb格式，運行AutoDock和AutodockTools，獲取對接最低結合能，根據對接結果篩選出最具可能性的蛋白結合位點。

1.5 富集分析

基于前10個Hub Gene做富集分析。利用DAVID網站中的基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)相關數據庫對其相關生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)和信號轉導通路進行富集分析與整合，建立數據文件。

根據P<0.05確定KEGG中涉及的信號轉導通路，并根據P值大小取前20條繪制氣泡圖，采用Cytoscape制作通路-靶點可視化網絡圖。確定BP、CC、MF涉及的相關條目，各選取前20條結果繪制條形圖。

2 結 果

2.1 活性成分獲取

根據數據庫篩選出33個MT有效活性成分，候選活性成分中，由于Tenacissoside A、H、I有大量文獻支持，故將此3種成分也納入后續研究，得到總有效活性成分36個，見表2。

表2 MT有效活性成分

2.2 MT活性成分及GC潛在靶點獲取

共得到MT活性成分潛在靶點499個, GC相關靶點871個，名稱轉換為基因名后利用Venn圖取交集得到130個交集基因，見圖1。

圖1 交集基因Venn圖

2.3 PPI網絡構建及核心基因篩選

String數據庫共篩選出116個關鍵基因，制作PPI網絡圖，并由Cytoscape可視化制作“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖(見圖2), Kaempferol、Tenasogenin、Drevogenin A等在MT抗GC作用中最突出。由MCC篩選的10個Hub Gene中(見圖3),SRC、PIK3CA、PIK3R1與MT治療GC作用機制的相關度較高。

A: String PPI網絡圖; B: “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。圖2 PPI網絡構建圖

圖3 Hub Gene篩選圖

2.4 分子對接

分子對接的最低結合能見表3, 根據表3絕對值作雷達圖將數據可視化，可以看出SRC、PTK2分別與Kaempferol及Caffeic acid對接最穩定，見圖4。圖5為蛋白位點結合模擬圖，充分說明了MT對GC的穩定作用。

表3 最低結合自由能 kcal/mol

圖4 分子對接數據可視化雷達圖

A: SRC與Kaempferol在THR-42、ASP-27、THR-23、TRP-47、ASP-44位點結合; B: SRC與Caffeic acid在LYS-43、LYS-67、ARG-68位點結合; C: PTK2與Kaempferol在ARG-550、PRO-585、ASN-628、LEU-584位點結合; D: PTK2與Caffeic acid在CYS-502、ASP-564、ILE-428位點結合。圖5 分子對接蛋白位點結合圖

2.5 富集分析

KEGG富集分析預測信號轉導通路57條，主要涉及ErbB、VEGF、EGFR、PI3K/Akt等，與以上信號通路最相關的基因為PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、GRB2(見圖6)。

A: KEGG通路富集分析氣泡圖; B: 通路-靶點可視化網絡圖。圖6 信號轉導通路富集分析

GO富集預測BP相關條目62個, CC相關條目16個, MF相關條目24個，各選取前20條繪制條形圖(見圖7)。MT抗GC作用過程與酪氨酸激酶受體2(ERBB2)信號通路、血管內皮生長因子受體(VEGFR)信號通路、表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、黏著斑等相關，其中可能涉及細胞質膜(plasma membrane)、頂端質膜(apical plasma membrane)、質膜細胞質側的外源成分(extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane)等CC, 并受Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase activity)、蛋白磷酸酶結合(protein phosphatase binding)、蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)等MF的影響。

A: GO-BP; B: GO-CC; C: GO-MF。圖7 GO富集分析

3 討 論

本研究利用網絡藥理學技術，整體評價MT與GC的網絡關系，并預測了MT作用于GC的分子機制。本研究通過搜索文獻及平臺大數據篩選并確定MT活性成分36種，網絡節點度值較大的Kaempferol、Tenacissoside H、Scopoletin、Caffeic acid等均可能在后續研發抗腫瘤新藥的過程中成為先導化合物。大量藥理研究結果發現, Kaempferol[37]具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用, Tenacissoside H[38-39]可通過影響PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導腫瘤細胞發生自噬, Scopoletin[40]具有抗氧化和抗炎特性，在誘導腫瘤細胞凋亡和自噬上發揮重要作用, Caffeic acid[41]可直接靶向Erk1/2以降低癌癥發生率，這提示MT治療GC的機制可能與促進腫瘤細胞的凋亡與自噬最為相關。

116個關鍵基因中通過MCC算法篩選出Hub Gene 10個，其中PTK2是非受體蛋白酪氨酸激酶，又叫黏著斑激酶(FAK), 可激活PI3K/Akt通路，促進腫瘤細胞侵襲與轉移[42];SRC能影響Ras/Raf/MEK/ERK及SRC/FAK通路，促進腫瘤細胞生長分化及遷移[43-44]; 此外,PIK3CA也參與調節PI3K/AKT通路影響腫瘤生成[45]。

GO富集分析中，VEGFR相關信號通路在BP富集較高，影響MT抗GC的主要生物過程，臨床已有針對VEGFR的治療藥物—單克隆抗體雷莫蘆及酪氨酸激酶抑制藥阿帕替尼，用于延長患者生存時間[46-47]; 帕尼單抗、西妥昔單抗及尼妥珠單抗則可作用于另一富集較高的EGFR抑制胃癌進展[48]。BP高富集的ERBB2可能對開發新靶向藥物具有指導意義。MF富集較高的蛋白酪氨酸激酶活性相關抑制藥物已被應用于臨床[47], 蛋白磷酸酶結合過程及Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶也可能成為新藥研發的突破點。結合KEGG富集, MT可能通過影響PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK、SRC/FAK等信號通路抑制GC的發生與發展。分子對接結果驗證了MT活性成分Kaempferol及Caffeic acid能夠與SRC、PTK2、HSP90AA1、PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、VEGFA、GRB2等受體蛋白自發結合，充分說明了預測結果的可信性。

目前，化療仍是晚期GC的主要治療手段，而腫瘤細胞耐藥及胃癌特效藥缺乏是近年來急需突破的難點，中藥聯合化療可增效減毒，提高患者生活質量。MT制劑現已被廣泛應用于肝癌、肺癌、胃癌、食管癌的聯合化療，對其活性成分進行研究不僅能為后續相關藥理研究提供理論基礎，還可能為GC相關通路中蛋白調節提供新的研究方向，對中晚期GC臨床用藥具有指導意義。

網絡藥理學作為兼具系統層次及生物網絡的新興學科，對臨床用藥指導及新藥研發產生了巨大影響，但其分析過程中存在較多不確定性[49], 因此本研究尚需進行蛋白水平實驗、細胞模型實驗、動物模型實驗及臨床試驗對MT治療GC分子機制加以驗證[50], 以完善本藥物理論研究。