紅景天苷對東莨菪堿誘導阿爾茨海默病模型大鼠炎癥因子的影響

田詩琪, 趙慧源, 張 帆, 翟春影, 安 昊, 馬韜智,梁汶彬, 王金亮, 吳淑琴

(齊齊哈爾醫學院, 黑龍江 齊齊哈爾, 161000)

阿爾茨海默癥(AD)是一種以認知功能損傷為主的慢性進行性中樞神經系統退行性疾病[1], 其病理學特征以神經炎性斑(NP)、神經原纖維纏結(NFT)、神經元死亡為主。有關AD發病機制的學說有膽堿能學說、自由基學說、β淀粉樣蛋白學說、炎癥和免疫學說、氧化應激學說等。本研究主要傾向于β淀粉樣蛋白學說、炎癥和免疫學說。黃振波等[2]指出白細胞介素-1β(IL-1β)可能會損害認知功能，但IL-1β與認知損傷的關系尚不十分清楚。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種炎癥介質，在一定條件下可以誘發炎癥反應。紅景天苷是藏藥紅景天的一種有效活性成分，在抗氧化損傷、清除自由基、促進細胞代謝、增強細胞活力等方面有獨特的功效[3-4]。本研究觀察AD大鼠應用紅景天苷前后的IL-1β、TNF-α水平變化，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物來源

無特定病原體(SPF)級雄性大鼠40只, 2～3月齡，體質量(200.0±10.0) g, 由大連醫科大學動物實驗中心提供，許可證號為SYXK(黑2016-001)。

1.2 藥物與AD模型制備

紅景天苷(北京普天同創生物科技有限公司，批號110818-200404)、東莨菪堿氫溴酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司，批號S817762)、IL-1β ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號202010723)、TNF-α ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號202010645)。采用腹腔注射東莨菪堿(SCOP) 2 mg/kg的方法, 建立中樞膽堿能系統障礙性AD模型大鼠[5-6]。

1.3 實驗分組

將40只大鼠隨機分為空白組、模型組以及紅景天苷高、中、低劑量組，每組8只。空白組和模型組均給予生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/(kg·d); 高、中、低劑量組分別給予75、50、25 mg/(kg·d)紅景天苷(需將純度>95%紅景天苷粉末與雙蒸水混合)。給予紅景天苷30 min后，除空白組外，其余4組大鼠均給予SCOP腹腔注射，劑量為2 mg/kg, 連續給藥21 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學檢測: 行為學檢測在給藥21 d后開始進行。Morris水迷宮實驗: 圓形水池，直徑160 cm, 深50 cm, 站臺直徑10 cm, 水面高于站臺平面約2 cm, 水溫控制在(27.0±1.0) ℃, 水池周圍以布簾遮擋。實驗內容包括適應水迷宮(第1天)、定位航行實驗(第2～5天)和空間探索實驗(第6天)。實驗前1 d將大鼠放置在實驗室進行適應，消除恐懼心理。定位航行實驗: 每只大鼠每天共進行4次，頭面向池壁，分別從水池4個不同象限邊緣的中點放入水中; 大鼠找到平臺后，讓其在平臺上停留10 s; 若大鼠在90 s內仍然沒有找到水面之下的平臺，引導其找到平臺，并在平臺上停留10 s; 記錄大鼠的運動軌跡及找到平臺時游過的距離。空間探索實驗在第7天進行，撤掉平臺，將大鼠由定位航行實驗平臺所在象限的對側放入，并記錄大鼠90 s內在目標象限(定位航行實驗放置平臺的象限)所游的距離、在水池中所游的總距離及穿越目標象限次數。以90 s內在目標象限游泳距離占總距離的百分比和穿越目標象限次數作為空間學習與記憶的評價指標[7-9]。

1.4.2 光鏡觀察細胞形態結構: 水迷宮實驗12 h后(禁食不禁水)，分別將5組大鼠采用鍘刀斷頭儀處死，立即開顱取大腦、海馬組織、血清樣本。大腦及海馬組織在-80 ℃凍存，恒冷箱切片，甲醛溶液固定切片。蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察神經細胞形態結構。

1.4.3 IL-1β及TNF-α測定: 取海馬組織，勻漿，離心取上清液，采用IL-1β、TNF-α的配套ELISA試劑盒，按照說明書方法檢測腦組織內的遞質含有量，應用全自動酶標儀檢測450 nm吸光度(OD450 nm)值。以吸光度為縱坐標，以標準品劑量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 Morris水迷宮運動軌跡

實驗第2天，高劑量組行動軌跡與空白組相似，大鼠對平臺位置的記憶能力優于模型組。見圖1。

A: 模型組軌跡(密集遍布4個象限,大鼠未記住平臺象限位置,仍在摸索尋找平臺); B: 空白組軌跡(相對集中在平臺相鄰的第2象限內,軌跡相對稀疏,可能對平臺位置存在潛在記憶); C: 高劑量組軌跡(相對集中在平臺相鄰的第4象限內,行動軌跡大致與空白組相似,對平臺位置的記憶能力優于模型組)。圖1 模型組、空白組及高劑量組大鼠Morris水迷宮運動軌跡

2.2 Morris水迷宮實驗結果

Morris水迷宮實驗結果顯示，高劑量組大鼠目標平臺象限搜索時間與穿越平臺次數比均高于模型組，紅景天苷模型組大鼠長于中劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05), 表明75 mg/kg紅景天苷能改善大鼠的學習記憶功能。見表1、表2、表3。

表1 各組目標平臺象限內的搜索時間與穿越平臺次數比情況

表2 各組大鼠到達平臺的時間 s

表3 各組大鼠的目標象限停留時間 s

2.3 各組大鼠腦TNF-α、IL-1β及海馬區域切片比較

與空白組相比，模型組大鼠腦TNF-α、IL-1β水平升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與模型組相比，高劑量組和中劑量組大鼠腦TNF-α、IL-1β水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 大鼠海馬區炎癥因子的變化

A: 空白組,神經細胞排列有序,染色密集,排列整齊緊密; B: 模型組,神經細胞數量明顯減少,散在,排列不整齊,組織疏松; C: 低劑量組,少量神經細胞恢復,但排列散在; D: 中劑量組,可見少量變形的神經元,病理改變相較模型組不明顯; E: 高劑量組,神經細胞普遍較細,細胞排列整齊、規則、緊密。圖2 各組大鼠海馬區域切片HE染色結果(放大倍數400倍)

3 討 論

研究[2]表明IL-1β與認知功能損傷有一定的聯系。在AD大鼠模型中, IL-1β、TNF-α水平顯著升高，促進白細胞浸潤、活化和炎癥瀑布反應。本研究觀察AD大鼠IL-1β、TNF-α在紅景天苷給藥前后的變化，發現紅景天苷對AD大鼠的學習及認知能力有改善作用，也進一步證明了IL-1β與認知能力的關系。

AD的主要病變部位在大腦，β淀粉樣蛋白堆積是其主要病理特征之一[10]。紅景天苷具有抗衰老、抗疲勞、保護心腦血管系統、調節免疫系統、防輻射、抗疲勞、抗腫瘤及增強免疫功能等藥理作用，其中抗炎作用可調節早期細胞因子引發的炎癥反應，通過阻斷核轉錄因子B和細胞外信號調節酶活化作用，從而減少TNF-α、IL-1β的分泌[11], 表明紅景天苷可用于治療炎癥反應介導的認知功能障礙，也可緩解海馬區的炎癥反應。

相比于注射的制備方法, SCOP下的AD模型制備可以直接模擬AD患者的記憶能力減退和學習記憶能力消失，更好地判斷炎癥因子的改變，避免了顱內手術造成的炎癥和神經元損傷，手術創傷不僅激活了外周的免疫反應，也激活了中樞神經系統的免疫反應。研究[12]顯示, IL-1β受體缺失大鼠術后神經炎癥反應減弱，認知功能受損的發生率明顯下降。

Morris水迷宮實驗結果表明，腹腔注射SCOP可影響模型組、低劑量組大鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間等指標。在最后1 d的定位巡航實驗中，模型組大鼠尋找平臺潛伏期增加，穿越平臺次數減少，且與紅景天苷治療劑量存在相關性，高劑量組與空白組變化趨勢相近，推測長期給予SCOP但不給予紅景天苷治療后，大鼠存在相對的學習記憶損傷。研究[13]發現AD患者腦內有過量的炎癥因子TNF-α、IL-1β表達，同時可激活星形膠質細胞和小膠質細胞，并增加其他促炎癥因子的釋放。β淀粉蛋白沉淀引起的一系列神經毒性作用可導致神經細胞功能紊亂和死亡，并引發癡呆，腦內慢性炎癥、氧化應激機制等起著重要的作用[14]。神經元受損是AD病變的一個關鍵癥狀[15], 海馬區神經元的損傷也是評估患者病情改善情況的重要指標。

綜上所述，紅景天苷能顯著增強AD大鼠的學習記憶能力，減輕海馬神經元的損傷，調節中樞炎癥狀態，修復海馬神經元的病理損傷，其機制可能與改善炎癥反應、增強免疫功能有關。