當歸四逆湯含藥血清對高糖培養SD大鼠背根神經元線粒體分裂及RhoA/ROCK通路的影響

向慶偉, 劉進進, 彭 朗, 劉 煜

(湖北省中醫院/湖北省中醫藥研究院/湖北中醫藥大學附屬醫院，湖北 武漢，430061)

糖尿病周圍神經病變(DPN)常可引發糖尿病患者神經性潰瘍、肢端疼痛，嚴重時可導致截肢[1-2]。高糖可誘導炎癥的發生，造成脊髓背根神經節細胞凋亡，是DPN發生的主要病理機制[3-4]。線粒體功能障礙與認知障礙、DPN等多種神經疾病密切相關，抑制線粒體分裂，可緩解糖尿病大鼠坐骨神經軸突損傷[5-6]。Ras同源基因家族成員A(RhoA)/Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)調控炎癥及線粒體分裂過程，下調通路蛋白表達，可抑制炎癥，減弱線粒體斷裂，促使神經細胞存活，改善順鉑誘導的周圍神經病變[7-8], 因而RhoA/ROCK可作為減輕背根神經元線粒體分裂的潛在作用靶點。當歸四逆湯能降低促炎因子表達，抑制炎癥[9-10], 聯合甲鈷胺應用，可減輕糖尿病引發的神經功能受損，對DPN具有明顯療效，但其藥理機制如今尚不清楚。本研究通過體外高糖培養斯潑累格·多雷(SD)大鼠背根神經元，探討當歸四逆湯含藥血清對線粒體分裂及RhoA/ROCK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

SD大鼠購自武漢云克隆動物有限公司 [生產許可證號SCXK(鄂)2018-0021], 當歸四逆湯(當歸9 g、桂枝9 g、芍藥9 g、細辛3 g、甘草6 g、通草6 g、大棗5枚)購自北京同仁堂，葡萄糖、杜氏改良Eagle培養基(DMEM)、Neurobasal培養基、B27細胞培養添加劑購自Gibco公司(貨號15023021、C11995500BT、21103049、17504-044), 胰蛋白酶、100×青霉素-鏈霉素溶液、特級胎牛血清、100×L-谷氨酰胺溶液購自上海生工生物工程股份有限公司(貨號A600626-0005、E607011、E600001-0500、E607004100X), 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)購自北京雷根生物技術有限公司(貨號CT0045), CCK-8細胞活力檢測試劑盒、活性氧(ROS)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)測試盒、白細胞介素-18(IL-18)測試盒、RIPA裂解液(高強度)、總蛋白定量測定試劑盒(BCA法)購自南京建成生物工程研究所(貨號G021-1-1、E004-1-1、A020-2-2、H007、H015、W062-1-1、A045-4-2); 兔源β-actin抗體、兔源ROCK抗體、兔源RhoA抗體、兔源動力相關蛋白1(Drp1)抗體、兔源分裂蛋白1(Fis1)抗體、兔源絲裂原融合蛋白1(MFN1)抗體、兔源絲裂原融合蛋白2(MFN2)抗體購自Abcam公司(貨號ab227387、ab45171、ab187027、ab184247、ab229969、ab221661、ab124773等)。酶標儀購自美國Thermo Fisher Science公司(型號MultiskanTMFC), 發光成像儀購自德國Healthcare公司(型號LAS 4000), 全能蛋白轉印系統購自美國Bio-Rad公司(型號Trans-Blot Turbo等)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備及大鼠背根神經元體外培養: 當歸四逆湯煎制后過濾，獲得生藥含量2.2 g/mL的藥液，取6只大鼠以12 mL/kg的劑量灌胃給藥[11], 另取6只大鼠灌胃等劑量生理鹽水(模型組)[12]。7 d后取大鼠頸動脈血, 4 000轉/min離心10 min, 分離得到含藥血清和正常血清, 56 ℃水浴滅活0.5 h, 0.22 μm過濾滅菌后，分裝保存于-80 ℃環境中。取正常SD大鼠1只，麻醉后處死，剝離脊髓，取出兩側背根神經節，剪碎后以胰酶消化20 min, 吹打后200目過篩，得到單細胞懸液, 12 000轉/min離心5 min, 以培養液(DMEM培養基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液)重懸細胞沉淀后計數，密度調為1×106個/mL, 接種培養6 h, 更換為神經元專用培養基(Neurobasal培養基+1%谷氨酰胺+2% B27細胞培養添加劑+1%青霉素-鏈霉素溶液)，每3 d半量換新的神經元專用培養基，細胞長至80%后，傳代培養。

1.2.2 細胞分組處理及材料收集: 取傳代培養的背根神經元，將其隨機分為對照組、高糖組、當歸四逆湯組，高糖組與當歸四逆湯組細胞以45 mmol/L的高糖處理24 h, 然后當歸四逆湯組細胞以10%的含藥血清處理[12], 對照組與高糖組血清正常處理, 24 h后收集各組細胞和培養液。

1.2.3 檢測各組細胞活力: 取傳代培養的背根神經元，以1×105個/mL的密度接種在96孔板，按照1.2.2中方法分組處理細胞，每組設6個復孔，另取6個孔(不接種細胞)作空白組，加入CCK-8處理，采用酶標儀測量450 nm波長下各孔吸光度(A), 計算細胞活力，細胞活力=[(模型組和當歸四逆湯組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)]×100%。

1.2.4 測定各組細胞ROS水平及其釋放的LDH、IL-6、IL-18水平: 取出分組處理后收集的背根神經元細胞，冰水浴下經RIPA裂解液裂解，離心收集上清液，取0.15 mL, 采用試劑盒測出各組細胞ROS水平，剩余細胞蛋白樣品液進行蛋白檢測。取出分組處理后收集的背根神經元細胞的培養液，離心后以試劑盒測出上清液中LDH、IL-6、IL-18的水平。

1.2.5 測定各組細胞線粒體膜電位: 取傳代培養的背根神經元，接種在12孔板，按照1.2.2中方法分組處理細胞，使用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位，具體操作參照說明書進行，以酶標儀測定的紅色熒光/綠色熒光的比值表示線粒體膜電位水平。

1.2.6 檢測各組細胞線粒體分裂蛋白、融合蛋白及RhoA/ROCK通路蛋白表達水平: 取出測定ROS水平后剩余的各組細胞蛋白樣品液，總蛋白濃度經BCA法測量后，將其煮沸變性，每組分別取含20 μg總蛋白的樣品液加入上樣孔中，電泳后濕轉(110 V, 1.5 h), 以3%牛血清白蛋白溶液封閉硝酸纖維膜上蛋白，剪取蛋白Drp1、Fis1、MFN1、MFN2、RhoA、ROCK、β-actin條帶，經對應一抗孵育后洗膜，經二抗孵育后洗膜，通過化學發光劑顯色，以發光成像儀拍照，條帶灰度值以Image J軟件定量分析，最終得出各蛋白相對表達。

1.3 統計學分析

實驗所得計量數據以平均數±標準差表示，并采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間進一步比較行LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元細胞活力的影響

與對照組(100.00%)比較，高糖組[(42.75±7.46)%]大鼠背根神經元細胞活力降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組[(86.83±12.05)%]背根神經元細胞活力升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元ROS水平及釋放LDH水平的影響

與對照組比較，高糖組背根神經元ROS水平及其釋放的LDH水平升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組背根神經元ROS水平及其釋放的LDH水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠背根神經元ROS水平及釋放的LDH水平比較

2.3 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元釋放IL-6、IL-18水平的影響

與對照組比較，高糖組背根神經元釋放的IL-6、IL-18水平升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組背根神經元釋放的IL-6、IL-18水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠背根神經元釋放IL-6、IL-18水平

2.4 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元線粒體膜電位的影響

對照組大鼠背根神經元線粒體膜電位為(3.23±0.51), 高糖組為(2.14±0.37), 當歸四逆湯組為(3.25±0.34)。與對照組比較，高糖組大鼠背根神經元線粒體膜電位降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組大鼠背根神經元線粒體膜電位升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元線粒體分裂蛋白及融合蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組大鼠背根神經元線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1表達升高，融合蛋白MFN1、MFN2表達降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組大鼠背根神經元線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1表達水平降低，融合蛋白MFN1、MFN2表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

A: 對照組; B: 高糖組; C: 當歸四逆湯組。圖1 免疫印跡檢測各組大鼠背根神經元線粒體分裂蛋白及融合蛋白表達

表3 各組大鼠背根神經元線粒體分裂蛋白及融合蛋白相對表達水平

2.6 當歸四逆湯含藥血清對高糖培養大鼠背根神經元RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響

與對照組比較，高糖組背根神經元RhoA/ROCK通路蛋白RhoA、ROCK表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與高糖組比較，當歸四逆湯組背根神經元RhoA/ROCK通路蛋白RhoA、ROCK表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。

A: 對照組; B: 高糖組; C: 當歸四逆湯組。圖2 免疫印跡檢測各組大鼠背根神經元RhoA/ROCK通路蛋白表達

表4 各組大鼠背根神經元RhoA/ROCK通路蛋白相對表達

3 討 論

線粒體動力學損傷及功能障礙與DPN的發病密切相關，高糖環境可增強背根神經元產生并積累ROS, 促使線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1的表達，抑制線粒體融合蛋白MFN的表達，破壞線粒體分裂與融合的動力學平衡，引起線粒體分裂過強，導致神經元損傷，進而造成視覺功能障礙、DPN等神經疾病[13-15]。本研究以高糖培養SD大鼠背根神經元，模擬DPN的致病過程，結果顯示，高糖培養能顯著升高大鼠背根神經元ROS水平，促進大鼠背根神經元釋放LDH、IL-6及IL-18, 促進Drp1及Fis1蛋白的表達，顯著降低細胞活力、線粒體膜電位、細胞MFN1及MFN2蛋白表達，表明高糖可誘導ROS及促炎因子大量產生釋放，促使線粒體分裂，引發線粒體功能損傷，導致神經元活力降低，基本符合DPN在細胞水平上的致病過程。

DPN的治療以控制血糖、補充神經營養為主，療效并不理想，且隨著社會發展，居民攝入營養過剩, DPN發病率越來越高，因此有效預防其發生和發展是迫切需要解決的臨床難點[1-2, 16]。中醫學將DPN歸屬于“血痹”“痿證”等范疇，脈絡瘀滯痹阻、氣血虧虛不暢是其主要病機。當歸四逆湯是《傷寒論》中的溫經散寒代表方劑，可補血散瘀、溫經通脈、振陽祛寒，廣泛應用于坐骨神經痛、DPN、類風濕性關節炎等疾病的臨床治療。現代藥理研究[9-10, 17-18]表明，當歸四逆湯可降低促炎因子水平，抑制炎癥反應，顯著改善DPN患者的臨床癥狀，但目前還沒有關于其藥理機制的準確闡述。研究[7-8, 19]發現，小G蛋白RhoA及其下游激酶ROCK在DPN的發病過程中發揮著重要調控作用，高糖可促進RhoA、ROCK表達，引發炎癥，進而上調Drpl的表達，增強線粒體分裂，導致背根神經元損傷凋亡，抑制RhoA/ROCK通路激活，減輕炎癥，下調Drp1表達，緩解線粒體斷裂，阻斷線粒體凋亡途徑，維持神經細胞正常生長及代謝，緩解神經病變癥狀，因而推測下調RhoA/ROCK通路可能是當歸四逆湯治療DPN的作用機制。本研究結果顯示，當歸四逆湯含藥血清處理高糖培養的大鼠背根神經元，可顯著降低背根神經元的ROS水平，增高LDH、IL-6及IL-18水平和細胞中Drp1、Fis1、RhoA及ROCK蛋白表達，顯著提升細胞活力、線粒體膜電位，增高細胞中MFN1及MFN2蛋白的表達，表明當歸四逆湯可抑制RhoA/ROCK信號的激活，減少ROS和炎性因子產生釋放，阻止炎癥反應的發生，減輕線粒體分裂，促使背根神經元存活，改善高糖誘導的神經細胞損傷。

綜上所述，當歸四逆湯可下調RhoA及ROCK蛋白的表達，抑制ROS和炎性因子合成釋放，阻止炎癥發生及進展，減弱線粒體分裂過程，提高高糖培養的背根神經元活力，減輕細胞損傷，在細胞水平上證實了對DPN的防治功效，值得臨床推廣使用。抑制RhoA/ROCK通路激活可能是當歸四逆湯治療DPN的藥理機制，后續會進行回復實驗對其進行深入探討。