LncRNA DDX11-AS1靶向miR-627-3p調控氧化低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞增殖和凋亡的機制研究

彭憲星, 王遠波, 孫啟朋

(棗莊礦業集團中心醫院 神經內科一病區, 山東 棗莊, 277000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種常見的高發病率、高死亡率的心血管疾病，是冠心病、心肌梗死和周圍血管疾病的主要病因[1]。內皮細胞在維持血管系統的動態平衡中起著重要作用，其損傷和功能障礙是AS的早期標志。在高血壓、高血脂等因素刺激下，內皮細胞表達的黏附分子可促進氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的局部積累，誘導促炎反應、氧化應激和內皮細胞凋亡，最終導致AS斑塊形成。因此，闡明ox-LDL介導血管內皮細胞凋亡的分子機制對開發有效的AS治療方法意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是序列高度保守、長度大于200 nt的RNA轉錄本，其通過染色質重塑、剪切調控、吸附微小RNA(miRNA)等多種機制參與基因表達調控，在癌癥、心血管疾病等病理過程中具有重要作用[2-3]。研究[4-5]顯示, lncRNA DDX11反義RNA 1(DDX11-AS1)在肝癌、結腸癌中表達上調，其通過調控細胞增殖和凋亡對癌癥進展具有促進作用。miR-627-3p已被證實[6]在骨肉瘤等惡性腫瘤中具有抑癌作用，上調miR-627-3p表達可抑制腫瘤形成。靶基因預測顯示miR-627-3p是DDX11-AS1的潛在靶點，但DDX11-AS1是否靶向miR-627-3p調控AS進展并不清楚。本研究分析ox-LDL誘導后，人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)中DDX11-AS1、miR-627-3p表達水平，探討DDX11-AS1參與HUVEC增殖和凋亡的分子機制，以期為AS防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

HUVEC購自中國科學院典型培養物保藏中心; 杜爾伯格伊戈爾培養基(DMEM)、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、ox-LDL購自美國Sigma公司; 逆轉錄試劑盒、SYBR Green master mix購自大連寶生物科技公司; 兩步法miRNA熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司; DDX11-AS1過表達質粒(pcDNA-DDX11-AS1)及其對照(pcDNA-con)、miR-627-3p抑制物(anti-miR-627-3p)及其對照(anti-miR-con)、DDX11-AS1小干擾RNA(si-DDX11-AS1)及其對照(si-con)、miR-627-3p模擬物(miR-627-3p mimics)及其對照(miR-con)、熒光素酶報告載體購自上海凱基生物公司; 細胞計數試劑盒(CCK-8)、TRIzol試劑、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)試劑盒、放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液購自北京索萊寶生物公司; 兔源細胞周期素D1(CyclinD1)、核因кB(NF-кB)、p65亞基(p-p65)、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體購自上海艾博抗生物技術公司; 兔源磷酸化的NF-кB抑制蛋白α(p-IкBα)抗體、羊抗兔IgG二抗購自上海賽信通生物技術公司。

1.2 動脈粥樣硬化細胞模型構建

HUVEC用添加10%的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中培養。用50 μg/mL的ox-LDL刺激HUVEC 48 h, 構建動脈粥樣硬化細胞模型。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA DDX11-AS1和miR-627-3p的表達

用TRIzol試劑分離HUVEC中總RNA。用逆轉錄試劑盒、SYBR Green master mix進行反轉錄和RT-qPCR反應。使用兩步法miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒測定miR-627-3p表達水平。分別以β-actin、U6為內參, 2-ΔΔCt法分析DDX11-AS1、miR-627-3p相對表達水平。DDX11-AS1引物序列: 上游5′-CAGCAACCTTTCTGGGAAGC-3′, 下游5′-ACAAG AGCTGAGCTTGTCTTT-3′。miR-627-3p引物序列: 上游5′-CACTCATCTTTTCTTTG-3′, 下游5′-GAGTCTCTTGAGAGT ACAT-3′。U6引物序列: 上游5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′, 下游5′-ACGCTTCACGAATTTGC-3′。β-actin引物序列: 上游5′-TCAC CCACACTGT GCCCATCTACGA-3′, 下游5′-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3′。

1.4 細胞轉染和實驗分組

將對數期HUVEC接種96孔板，用Lipofectamine 2000將pcDNA-con、pcDNA-DDX11-AS1、anti-miR-con、anti-miR-627-3p、pcDNA-DDX11-AS1+miR-con、pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p mimics分別轉染HUVEC細胞, 48 h后用50 μg/mL的ox-LDL刺激HUVEC 48 h, 依次記為ox-LDL+pcDNA-con組、ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1組、ox-LDL+anti-miR-con組、ox-LDL+ anti-miR-627-3p組、ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+ miR-con組、ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p組。收集各組細胞進行后續實驗。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖

將轉染或未轉染的HUVEC(3×103個/孔)接種到96孔板，設置3個重復。采用50 μg/mL的ox-LDL孵育48 h, 按10 μL/孔加入CCK-8溶液，繼續培養3 h。酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD-對照組OD)×100%

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

ox-LDL刺激48 h后，胰蛋白酶消化，結合緩沖液重懸各組HUVEC。分別加入5 μL的Annexin V-FITC、PI, 室溫下于黑暗環境中染色15 min, 流式細胞儀檢測凋亡細胞。以早期(Annexin V-FITC染色, PI染色陰性)和晚期凋亡率(Annexin V-FITC和PI染色均為陽性)之和表示細胞凋亡率。

1.7 蛋白質印跡(Western blot)檢測Cleaved-caspase-3、p-p65、CyclinD1和p-IкBα蛋白表達水平

使用RIPA裂解緩沖液裂解各組HUVEC。聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質，然后進行濕法轉膜。5%脫脂牛奶緩沖液25 ℃孵育膜1 h以防止非特異性結合。然后加入一抗溶液4 ℃孵育過夜，二抗溶液室溫孵育1 h后，使用增強型化學發光試劑檢測膜中的蛋白條帶。Image J軟件分析目的條帶相對灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

LncBase Predicted v.2在線預測miR-627-3p與DDX11-AS1之間存在潛在互補序列。將含有miR-627-3p結合位點的DDX11-AS1序列插入pmirGLO熒光素酶報告載體構建野生型(WT)DDX11-AS1報告載體(DDX11-AS1-WT), 同時通過突變(MUT)miR-627-3p的結合位點得到相應的突變體(DDX11-AS1-MUT)。用DDX11-AS1-WT、DDX11-AS1-MUT分別與miR-con、miR-627-3p共轉染HUVEC, 熒光素酶活性分析試劑盒檢測轉染48 h后熒光素酶活性。為證實DDX11-AS1對miR-627-3p的調控作用，將pcDNA-con、pcDNA-DDX11-AS1、si-con、si-DDX11-AS1分別轉染HUVEC, RT-qPCR檢測轉染48 h后miR-627-3p表達水平。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 ox-LDL處理的HUVEC中LncRNADDX11-AS1、miR-627-3p的表達情況

ox-LDL處理48 h后, RT-qPCR檢測HUVEC中LncRNA DDX11-AS1和miR-627-3p表達, ox-LDL組HUVEC細胞中LncRNA DDX11-AS1表達水平低于對照組, miR-627-3p表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ox-LDL處理的HUVEC中LncRNA DDX11-AS1、miR-627-3p的表達情況

2.2 上調DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術、RT-qPCR、Western blot檢測結果顯示，與對照組比較, ox-LDL組HUVEC存活率、DDX11-AS1表達水平、CyclinD1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05), 凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC存活率、DDX11-AS1表達水平、CyclinD1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05), 凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。表明上調DDX11-AS1表達可抑制OX-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖。見圖1、表2。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統計圖。與對照組比較, ?P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, #P<0.05。圖1 上調DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表2 上調DDX11-AS1表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.3 下調miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術、RT-qPCR、Western blot檢測結果顯示，與ox-LDL+anti-miR-con組比較, ox-LDL+anti-miR-627-3p組HUVEC凋亡率、miR-627-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達降低，存活率和CyclinD1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。表明下調miR-627-3p表達可抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖。見圖2、表3。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統計圖。與ox-LDL+anti-miR-con組比較, ?P<0.05。圖2 下調miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表3 下調miR-627-3p表達對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.4 LncRNA DDX11-AS1靶向miR-627-3p

LncBase Predicted v.2預測到miR-627-3p與LncRNA DDX11-AS1存在特異結合位點，見圖3。雙熒光素酶活性檢測顯示，與轉染miR-con比較，轉染miR-627-3p mimics可降低DDX11-AS1-WT的熒光素酶活性，差異有統計學意義(P<0.05),而對DDX11-AS1--MUT的熒光素酶活性無顯著影響，見表4。RT-qPCR檢測結果顯示, pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC中miR-627-3p表達水平較pcDNA-con組降低，差異有統計學意義(P<0.05); si-DDX11-AS1組HUVEC中miR-627-3p表達水平較si-con組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。表明DDX11-AS1靶向負性調控miR-627-3p表達。

圖3 LncRNA DDX11-AS1靶向miR-627-3p

表4 雙熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-627-3p的表達

2.5 上調miR-627-3p表達可以逆轉DDX11-AS1上調對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

CCK-8、流式細胞術、RT-qPCR、Western blot檢測結果顯示，與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+ miR-627-3p組HUVEC凋亡率、miR-627-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，存活率和CyclinD1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表6。表明上調miR-627-3p表達可逆轉DDX11-AS1上調對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響。

A: 流式細胞儀檢測細胞凋亡圖; B: Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達; C: CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達的柱狀統計圖。與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ?P<0.05。圖4 上調miR-627-3p表達可以逆轉DDX11-AS1上調對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

表6 上調miR-627-3p表達可以逆轉DDX11-AS1上調對ox-LDL處理的HUVEC增殖和凋亡的影響

2.6 NF-κB信號通路相關蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，與對照組比較, ox-LDL組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, ox-LDL+ pcDNA-DDX11-AS1+miR-627-3p組HUVEC細胞中p-p65和p-IкBα表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表7。表明DDX11-AS1靶向miR-627-3p在AS進展中的作用可能與抑制NF-κB途徑有關。

A: Western blot檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達; B: p-p65、p-IкBα蛋白表達的柱狀統計圖。與對照組比較, ?P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-con組比較, #P<0.05; 與ox-LDL+pcDNA-DDX11-AS1+miR-con組比較, &P<0.05。圖5 NF-κB信號通路相關蛋白的表達

表7 NF-κB信號通路相關蛋白的表達

3 討 論

研究[7]表明, lncRNA參與包括心血管疾病在內的多種人類疾病的病理生理過程。本研究旨在闡明AS中DDX11-AS1對血管內皮細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制。

DDX11-AS1位于染色體12p11.21位點，與胃癌、膀胱癌進展密切相關[8-10]。研究[8]顯示, DDX11-AS1在胃癌組織和細胞中表達升高，下調DDX11-AS1表達，顯著降低胃癌細胞的增殖和克隆形成能力，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。DDX11-AS1通過靶向miR-326調節奧沙利鉑耐藥胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[9]。此外, DDX11-AS1通過直接與miR-499b-5p促進腫瘤生長，進而加劇膀胱癌進展[10]。這些研究表明DDX11-AS1在人類疾病中起重要作用。本研究顯示, ox-LDL刺激HUVEC存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，這與霍鑫等[11]報道一致。同時，本研究顯示ox-LDL刺激降低DDX11-AS1水平，提示DDX11-AS1低表達可能參與ox-LDL誘導的HUVEC損傷。功能分析顯示，上調DDX11-AS1可減輕ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，下調促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達，上調CyclinD1蛋白表達，提高細胞存活率。以上結果提示，上調DDX11-AS1表達可抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷，抑制AS發生發展。

研究[12-13]表明, lncRNAs通過與特異性miRNA結合調節下游靶基因表達參與膽固醇代謝、血管內皮細胞凋亡、炎癥反應等AS進展的多個生物學過程。miR-627-3p在肺癌中具有抑癌功能，敲除lncRNA RP11-284F21.9, 通過上調miR-627-3p可抑制肺癌腫瘤形成[14]。本研究顯示, ox-LDL刺激后HUVEC中miR-627-3p表達顯著升高，轉染anti-miR-627-3p下調miR-627-3p表達，可抑制ox-LDL誘導的HUVEC存活率下降和細胞凋亡，促進CyclinD1表達，抑制Cleaved-caspase-3表達，與上調DDX11-AS1表達的作用一致。采用雙熒光素酶報告基因和RT-qPCR檢測進一步驗證二者關系發現, DDX11-AS1對miR-627-3p具有靶向負調控作用。此外，上調miR-627-3p表達，還可逆轉DDX11-AS1上調對ox-LDL處理的HUVEC增殖、凋亡的影響，這進一步說明DDX11-AS1通過靶向miR-627-3p抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，促進細胞增殖，抑制AS進展。

NF-κB是炎癥和免疫穩態的重要調節劑，其激活可誘導促炎因子表達、內皮損傷和脂質沉積，從而導致AS的形成和進展[15-16]。本研究顯示, ox-LDL刺激可抑制p65和IкBα的磷酸化，上調DDX11-AS1表達，則降低ox-LDL對p65和IкBα磷酸化的影響，而上調miR-627-3p表達，可逆轉DDX11-AS1上調的作用。以上研究說明, DDX11-AS1靶向miR-627-3p在AS進展中的作用可能與抑制NF-κB途徑有關。

綜上所述, LncRNA DDX11-AS1通過靶向miR-627-3p能夠抑制ox-LDL誘導HUVEC凋亡，促進細胞增殖，其機制可能與抑制NF-κB途徑有關。因此，靶向DDX11-AS1/miR-627-3p有望成為臨床防治AS的重要策略。