傷害誘導(dǎo)普通白木香與奇楠種質(zhì)沉香中倍半萜類成分及早期倍半萜合酶基因表達(dá)的差異分析△

呂菲菲，楊云，孫佩文，馮劍，劉培衛(wèi)，劉洋洋，徐艷紅*，魏建和，*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 海口 570311；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

沉香是 瑞香科（Thymelaeaceae）沉 香屬（AquilariaLam.）或擬沉香屬植物傷害誘導(dǎo)防御反應(yīng)形成的含樹脂木材，是中國的傳統(tǒng)名貴中藥，廣泛應(yīng)用于中成藥、藏藥和日本漢方藥中[1-2]。因具有獨(dú)特的芳香氣味，沉香也被廣泛用于熏香香料行業(yè)，是高級香水香料的定香劑[3]。奇楠被認(rèn)為是品質(zhì)優(yōu)良的沉香，外表油潤光滑，香味醇厚，味微苦、麻、辣、清涼[4]。中國產(chǎn)的奇楠沉香以野生采挖為主[5]，香農(nóng)在野外采香的過程中發(fā)現(xiàn)某些白木香樹經(jīng)輕微傷害后可以持續(xù)地形成奇楠沉香，但這種優(yōu)良性狀很難通過有性繁殖而延續(xù)。近年來，香農(nóng)將采挖的野生奇楠沉香樹木進(jìn)行嫁接擴(kuò)繁，獲得了可穩(wěn)定遺傳的奇楠種質(zhì)，通過鉆孔法傷害成功地生產(chǎn)了奇楠沉香，由奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香已流通于市場。

倍半萜是沉香的主要成分之一，只有受傷害后才會在莖干、枝條和根內(nèi)大量合成，其組成和含量決定了沉香的藥用價值和芳香氣味[6]。奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香顏色重、油性大、香味獨(dú)特，明顯不同于普通白木香生產(chǎn)的沉香，可見2 種種質(zhì)生產(chǎn)的沉香中倍半萜組分和含量有所不同，但倍半萜合成差異的分子調(diào)控機(jī)制尚缺乏研究。倍半萜合酶是白木香傷害誘導(dǎo)合成倍半萜的關(guān)鍵催化酶，其活性受基因表達(dá)調(diào)控[7]。健康白木香中倍半萜合酶幾乎不表達(dá)，外界傷害刺激后，才會被激活誘導(dǎo)表達(dá)[8]，倍半萜合酶基因表達(dá)一定程度上決定了白木香受到傷害后倍半萜合成的種類和含量。基于此，本研究以一種生產(chǎn)上的奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)為研究對象，分析2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分的差異，以及傷害早期顯著響應(yīng)的7 個倍半萜合酶基因（AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23）誘導(dǎo)表達(dá)模式，初步分析這2 種種質(zhì)傷害誘導(dǎo)形成倍半萜差異的機(jī)制，也為沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定和篩選、結(jié)香分子機(jī)制的解析提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

奇楠種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自廣東省茂名市電白區(qū)觀珠鎮(zhèn)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所采用DNA boarding 技術(shù)鑒定為白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg。普通白木香種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自海南省海口市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海口研發(fā)中心。

乙醚（西隴科學(xué)股份有限公司）；液氮（純度＞99.99%，海南佳騰化工氣體有限公司）；EASY-spin plus RN38型植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart?Top Green qPCR SuperMix、瓊脂糖均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

XPE 105 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；7890A型氣相色譜-質(zhì)譜儀（安捷倫公司）；Nano Drop 2000C 超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）；LightCycler?96 型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（霍夫曼·羅氏公司）；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MiniVac Beta 型真空離心濃縮干燥機(jī)（Labogene 公司）；ChemiDoc?XRS+型凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 倍半萜提取與測定

沉香倍半萜提取參考文獻(xiàn)［9］方法，準(zhǔn)確稱取結(jié)香2 年沉香0.5 g，液氮研磨成粉，向粉末中加入乙醚5 mL，冰浴超聲提取30 min，靜置5 min，收集上清液備用。向沉淀中再次加入乙醚5 mL，重復(fù)提取2 次，合并3 次收集的上清液，真空旋轉(zhuǎn)干燥，向干燥物中加入乙醚1 mL 溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過后，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測定化學(xué)組分。

GC 分析條件：毛細(xì)管柱為HP-5MS 5% Phenyl Silox（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣；柱體積流量為1.0 mL·min-1，不分流；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；升溫程序：初始柱溫60 ℃，保持2 min，5 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min，共運(yùn)行50 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為m/z50～300。

2.2 莖干總RNA提取和cDNA合成

選取3 年生健康莖干，直徑為（1.2±0.2）cm，對莖干進(jìn)行全斷干傷害處理，并分別在傷害后0、2、6、24 h 截取傷口處2 cm 莖干（傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期0～24 h 是傷害信號傳遞、防御反應(yīng)啟動、基因誘導(dǎo)表達(dá)相對最活躍階段），立即投入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

全斷干傷害處理莖干經(jīng)液氮研磨成粉，按照試劑盒說明書提取莖干總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，測定RNA 濃度。取所提取的RNA 約500 ng，根據(jù)要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，作為qRT-PCR模版。測定cDNA濃度。

2.3 qRT-PCR檢測基因表達(dá)

根據(jù)本課題組白木香全基因組注釋的倍半萜合酶基因序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），由廣州艾基生物有限公司合成，所有引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物由廣州艾基生物有限公司測序驗(yàn)證。

qRT-PCR 檢測基因表達(dá)量：20 μL PCR 體系包含Mix enzyme 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 1 μL 和雙蒸水（ddH2O）7 μL。qRT-PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，按不同基因引物退火溫度退火15 s（表1），72 ℃延伸20 s，共40 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個重復(fù)。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參[10]，將qRT-PCR 所得的樣品Ct值利用2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)化為基因相對表達(dá)量值。使用SPSS 1.1.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)顯著性分析，結(jié)果以（-x±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 沉香倍半萜合酶基因引物和擴(kuò)增片段

3 結(jié)果與分析

3.1 倍半萜類成分差異

GC-MS 測定后，將測得的化合物與NIST 數(shù)據(jù)庫比對，對匹配度＞75%的21個倍半萜及其衍生物進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)普通白木香所結(jié)的沉香中有17個，奇楠沉香中有16 個，在奇楠沉香中檢測到的香橙烯、檸檬烯、α-馬欖烯、石竹烯4個倍半萜類化合物在普通白木香結(jié)的沉香中沒有檢測到，而普通白木香所結(jié)沉香中存在的蛇麻烯、（-）-馬兜鈴烯、別香橙烯、長葉醛、香橙烯氧化物1 也沒有在奇楠沉香中檢測到，可見2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分差異較大。對兩者共有成分相對含量進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)倍半萜及其衍生物在兩者中的相對含量也有所不同，如普通白木香所結(jié)沉香中α-檀香醇的相對含量是奇楠沉香的6 倍左右，而奇楠沉香中α-愈創(chuàng)木烯相對含量是普通白木香所結(jié)沉香的2 倍有余（表2），綜上，奇楠沉香和普通白木香所結(jié)的沉香中倍半萜組分和含量差異明顯。

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對比（, n=3）

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對比（, n=3）

注：根據(jù)Duncan′s多區(qū)間統(tǒng)計(jì)分析，上標(biāo)不同字母代表各組間P＜0.05。

3.2 倍半萜合酶基因檢測

提取莖干的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測明顯有18S 和28S 2 條帶，條帶清晰，無拖尾，28S/18S 約為1.5（圖1），說明提取的莖干總RNA 質(zhì)量較好，經(jīng)反轉(zhuǎn)后可用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

圖1 2種白木香莖干總RNA凝膠電泳

根據(jù)白木香全基因組（PRJNA524272）及前期白木香倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)模式[11]分析發(fā)現(xiàn)，傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著響應(yīng)的倍半萜合酶基因主要為AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23。經(jīng)PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小與設(shè)計(jì)引物得到的片段大小基本一致（圖2）。將PCR產(chǎn)物測序，所得結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對，所有序列比對結(jié)果均符合全基因組注釋結(jié)果，即所有擴(kuò)增產(chǎn)物為倍半萜合酶的DNA序列。

圖2 7個倍半萜合酶基因在傷害處理白木香莖干中PCR擴(kuò)增條帶

3.3 普通白木香倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)

對已驗(yàn)證序列的7個傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)倍半萜合酶基因進(jìn)行了qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)普通白木香AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23基因均響應(yīng)于傷害誘導(dǎo)，傷害24 h 內(nèi)基因表達(dá)量均先上升，2 h 達(dá)到最大值后下降，誘導(dǎo)表達(dá)最大相對倍數(shù)均在幾十倍到幾百倍，誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度明顯（圖3），說 明AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23均強(qiáng)烈響應(yīng)于普通白木香的早期傷害誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)表達(dá)模式基本一致，呈先上升后下降的態(tài)勢。

圖3 不同傷害處理時間對普通白木香種質(zhì)中7個倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)水平的影響（, n=3）

3.4 奇楠種質(zhì)倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)qRT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)除AsTPS18基因外，奇楠 種質(zhì)中的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因也都響應(yīng)于傷害刺激，但各基因響應(yīng)傷害誘導(dǎo)的表達(dá)模式不同，AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17和AsTPS23基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，基因表達(dá)量呈遞增態(tài)勢，AsTPS20則呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢，傷害誘導(dǎo)6 h 表達(dá)量最高，這6 個倍半萜合酶基因傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)最大表達(dá)相對倍數(shù)集中于十幾倍到幾十倍，與普通白木香相比誘導(dǎo)響應(yīng)強(qiáng)度較低（圖4）。AsTPS18基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達(dá)不明顯，6 h 達(dá)到最大表達(dá)量，僅為3.60，遠(yuǎn)低于普通白木香中的誘導(dǎo)相對表達(dá)量，其在奇楠種質(zhì)中可能不是早期響應(yīng)傷害的倍半萜合酶基因。說明除AsTPS18外，其余6 個倍半萜合酶基因在奇楠種質(zhì)中均在傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期有所響應(yīng)，但與普通白木香中的基因誘導(dǎo)表達(dá)模式不一致，誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度相對普通白木香較低。

圖4 不同傷害處理時間對奇楠種質(zhì)中7個倍半萜合酶基因表達(dá)水平的影響（, n=3）

3.5 健康奇楠種質(zhì)與普通白木香倍半萜合酶基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探索2 種種質(zhì)的差異，對比了奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)倍半萜合酶基因表達(dá)情況（圖5），發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中響應(yīng)早期傷害的7 個倍半萜合酶基因在健康莖干中幾乎不表達(dá)，而奇楠種質(zhì)中除AsTPS2與AsTPS20外，AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18表達(dá)明顯，且高于健康白木香，說明健康的奇楠種質(zhì)和普通白木香中倍半萜合酶基因的表達(dá)也存在明顯差異。

圖5 奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)7個倍半萜合酶基因表達(dá)對比（, n=3）

4 討論

倍半萜是沉香的主要成分之一，其含量和組分在一定程度上決定了沉香的含油量和香味[4,12]。目前，奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香含油量高，香味醇厚，品質(zhì)明顯高于普通白木香種質(zhì)所結(jié)沉香。為了探索2種種質(zhì)結(jié)香差異及篩選優(yōu)良種質(zhì)，本研究選取一種市面上大量推廣嫁接的奇楠種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其生產(chǎn)的奇楠沉香與普通白木香所結(jié)沉香的倍半萜組分有所不同，且共有組分含量差異也較大，說明在相同傷害下，奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)誘導(dǎo)合成沉香倍半萜的分子調(diào)控機(jī)制存在差異，兩者倍半萜組分和含量的差異可能是奇楠沉香品質(zhì)優(yōu)于普通白木香種質(zhì)的關(guān)鍵原因。該發(fā)現(xiàn)與大麻不同品種間萜類組分不同的研究結(jié)果相一致[13]。

倍半萜是沉香屬植物受傷害后形成的次生代謝產(chǎn)物，植物中多種因子協(xié)同調(diào)控其合成[14-17]。倍半萜合酶就是倍半萜合成的關(guān)鍵催化酶，可催化法呢烯焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）形成不同的倍半萜骨架[7]。本研究發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著誘導(dǎo)高表達(dá)的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因在奇楠種質(zhì)中響應(yīng)強(qiáng)度較低，而AsTPS18基因在奇楠種質(zhì)中幾乎不響應(yīng)于早期傷害誘導(dǎo)，可見倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制在奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)中差異顯著，表明2 種種質(zhì)傷害后啟動防御反應(yīng)的機(jī)制有所不同，致使誘導(dǎo)合成倍半萜的組分和含量不同。此外，還發(fā)現(xiàn)AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18基因在健康奇楠種質(zhì)中表達(dá)量顯著高于健康白木香，說明奇楠種質(zhì)中倍半萜合酶基因表達(dá)更為敏感，這可能是盛傳的奇楠種質(zhì)不傷害也能產(chǎn)生奇楠沉香的原因。倍半萜合酶基因的差異表達(dá)機(jī)制是奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)傷害誘導(dǎo)結(jié)香性能差異的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，本研究首次從基因表達(dá)層面解析2 種種質(zhì)結(jié)香性能差異，對其深入研究有助于完善沉香形成機(jī)制，差異表達(dá)倍半萜合酶的篩選和論證將為新的分子標(biāo)記開發(fā)和沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定提供參考。