基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討清肺飲治療支氣管哮喘的作用機(jī)制

王 瑩 劉麗琴

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，通常由環(huán)境過敏原引起，具有復(fù)雜的病理機(jī)制，臨床表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶、咳嗽。此外，支氣管哮喘也可引起呼吸衰竭、心血管疾病、腎臟疾病、猝死等并發(fā)癥[1-2]。支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制包括氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、可逆性氣道受限、氣道重塑、氣道免疫炎癥和神經(jīng)調(diào)節(jié)，多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等）及細(xì)胞組分參與氣道炎癥的發(fā)生[3]。支氣管哮喘歸屬中醫(yī)“哮證”“喘證”“上氣”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為，哮病的發(fā)生是由于宿痰伏肺，遇誘因或感邪引觸，以致痰阻氣道，肺失肅降，痰氣相搏所引起的發(fā)作性痰鳴氣喘疾患。清肺飲（又名宣肺止咳合劑）是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院院內(nèi)制劑，由麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏七味藥組成，具有止咳平喘、清熱宣肺的功效，對支氣管哮喘有良好的治療作用，臨床療效顯著[4]，但具體的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，采用“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的方法，系統(tǒng)地研究“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的相互作用，其觀念與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的原則一致[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整體性探究清肺飲治療支氣管哮喘的作用機(jī)制，以期為清肺飲的基礎(chǔ)研究提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1清肺飲中化學(xué)成分的收集 借助中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/），檢索得到清肺飲中藥物麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏的化學(xué)成分。

1.2藥物有效成分篩選 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫以“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、細(xì)胞滲透性（Caco-2）＞-0.4”[7]為篩選條件對清肺飲所含化合物進(jìn)行篩選，并查詢其對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。收集化合物靶標(biāo)蛋白后再通過UniProt 數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為規(guī)范的靶點(diǎn)蛋白基因標(biāo)識符（Gene Symbol）。

1.3支氣管哮喘相關(guān)疾病靶點(diǎn)的遴選 借助Genecards、OMIM 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)于支氣管哮喘疾病的靶點(diǎn)，以“asthma”為檢索詞進(jìn)行檢索，收集整合得到與支氣管哮喘疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將清肺飲所含中藥、化合物及交集靶點(diǎn)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對其進(jìn)行分析，結(jié)合在線韋恩圖Venny 2.1，得出不同藥物之間的交集化合物，探討清肺飲的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.5PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將清肺飲與支氣管哮喘交集后的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，并將限定物種為“Homosapiens”設(shè)定最低相互作用閥值為“high confidence”0.700 其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，進(jìn)行篩選。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并按“degree”大小進(jìn)行篩選，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6靶點(diǎn)通路分析 為了進(jìn)一步了解交集基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），在DAVID 的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，Select Identifier 選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 設(shè)置為“Gene List”，提交基因列表，并限定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析，根據(jù)Count 排序取前20，將其結(jié)果利用Graphpad Prism 繪制成柱狀圖，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）數(shù)據(jù)庫繪制氣泡圖，進(jìn)行可視化。

1.7成分-靶點(diǎn)分子對接 利用AutoDock 軟件對清肺飲篩選得到的Degree 前5 位的核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分以及臨床常用治療藥物進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。具體步驟如下：（1）先從PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載核心靶蛋白的結(jié)構(gòu)3D 結(jié)構(gòu)的PDB 格式文件，并運(yùn)用PyMOL 軟件對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行去水、去配體等操作，最后使用AutoDock 軟件對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫及計(jì)算電荷處理后，保存為pdbqt 格式文件。（2）在TCMSP 網(wǎng)站下載活性成分的結(jié)構(gòu)文件（MOL2 格式），再用ChemOffice 軟件轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)，并使其結(jié)構(gòu)能量最小，最后使用AutoDock 軟件對3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫及計(jì)算電荷處理后，保存為pdbqt 格式文件。（3）利用AutoDock 對成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性進(jìn)行評價(jià)，最后運(yùn)用PyMOL 軟件使對接文件可視化。

2 結(jié)果

2.1活性化合物篩選結(jié)果 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)“OB≥30%、DL≥0.18，Caco-2＞-0.4”篩選后，搜索到134 個(gè)符合條件的有效化合物，其中麻黃20個(gè)，葛根3 個(gè)，知母14 個(gè)，苦杏仁18 個(gè)，甘草88 個(gè)，整合后得到128 個(gè)化合物。

2.2 清肺飲成分靶點(diǎn)與支氣管哮喘疾病靶點(diǎn)交集結(jié)果 清肺飲篩選的成分對應(yīng)的靶點(diǎn)有121 個(gè)，按“1.3”項(xiàng)方法篩選到與支氣管哮喘相關(guān)的靶7553 個(gè)，二者交集韋恩圖見圖1。

圖1 清肺飲靶點(diǎn)與支氣管哮喘靶點(diǎn)Venn 圖

2.3藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括259 個(gè)節(jié)點(diǎn)（5 個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)、133 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、121 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1274 條邊，如圖2 所示，綠色箭頭代表藥材，圓形代表化合物，藍(lán)色正方形代表靶點(diǎn)基因，玫紅色代表麻黃藥材所含的化合物，紫色代表葛根藥材所含的化合物，橘色代表知母藥材所含的化合物，黃色代表苦杏仁藥材所含的化合物，紅色代表甘草藥材所含的化合物，每條邊表示藥材中所含化合物及化合物與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。從圖中可看出清肺飲中存在一個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)作用，同時(shí)也存在不同化合物共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)的數(shù)量，利用節(jié)點(diǎn)度值排序確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)是目前網(wǎng)絡(luò)分析的主要策略之一，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選的中心度值（betweenness centrality）、親中心度值（closeness centrality）、等級值（degree）較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，一般認(rèn)為節(jié)點(diǎn)的連接度大于等于所有節(jié)點(diǎn)連接度2 倍中位數(shù)則對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)具有重要的貢獻(xiàn)意義。網(wǎng)絡(luò)中度值大于2倍中位數(shù)（成分度值中位數(shù)＝8，靶點(diǎn)度值中位數(shù)＝3）的成分有11 個(gè)，靶點(diǎn)有26 個(gè)。排名前5 位的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-異鼠李素、MOL000449-豆甾醇，度值分別是78、35、29、18、18，排名前10位的靶點(diǎn)分別是ESR1、PPARG、AR、NCOA2、PTGS1、PRSS1、GSK3B、ESR2、CHEK1、ACHE，度值分別為87、81、80、70、69、67、63、60、54、31。

圖2 清肺飲藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4清肺飲中交集化合物 由藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可知，清肺飲中不同的藥材里面存在相同的化合物的情況可知，MOL000422-山柰酚為麻黃、知母、甘草所共有；MOL000098-槲皮素為麻黃、甘草所共有；MOL000449-豆甾醇為麻黃、知母、苦杏仁所共有；MOL000358-β-谷甾醇為麻黃、葛根所共有；MOL000492-兒茶素為麻黃、苦杏仁所共有，MOL000392-芒柄花黃素為葛根、甘草所共有，MOL000359 -谷甾醇、MOL002311 -甘草醇、MOL004841-甘草查爾酮B、MOL004908-光甘草定、MOL005017-3，9-二羥基-4-異戊二烯基香豆素為甘草、苦杏仁所共有。

2.5PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述101 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白相互作用數(shù)據(jù)信息，然后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，選取其中度值（degree）大于2 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)有14 個(gè)，這14 個(gè)靶蛋白可能是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，構(gòu)建14 個(gè)核心靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3），網(wǎng)絡(luò)中共有14 個(gè)節(jié)點(diǎn)和66條邊，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺依據(jù)degree 而設(shè)定，即節(jié)點(diǎn)越大和顏色越深對應(yīng)的靶基因的degree 越大。

圖3 清肺飲核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6靶點(diǎn)通路分析 DAVID 中GO 功能富集分析得到GO 條目252 個(gè)（FDR＜0.05），其中生物過程（BP）條目116 個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目44 個(gè)，分子功能（MF）條目92 個(gè)，分別占46%、17%、37%，排名前20 位的條目見圖4。

圖4 清肺飲作用靶點(diǎn)的GO 富集分析的前20 個(gè)通路

KEGG 通路富集篩選得到79 條信號通路（P＜0.05），涉及癌癥通路、乙型肝炎通路、TNF 信號通路、MAPK 通路等，見圖5。

圖5 清肺飲作用靶點(diǎn)KEGG 富集分析的前20 條通路氣泡圖

2.7清肺飲關(guān)鍵活性成分-支氣管哮喘靶基因-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖 基于Cytoscape 軟件平臺，選取degree 排名前20 的清肺飲主要活性成分節(jié)點(diǎn)、120 個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)、20 個(gè)KEGG 信號通路構(gòu)建清肺飲關(guān)鍵成分-靶基因-信號通路的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 成分-核心靶點(diǎn)-信號通路圖

2.8分子對接結(jié)果和分析 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 位的化合物分別是MOL000098 -槲皮素、MOL000422 -山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-異鼠李素、MOL000449-豆甾醇，PPI 中degree 值排名前5 位的核心靶點(diǎn)分別是：MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA。將PPI中degree 值排名前五位的核心靶點(diǎn)與藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 位的化合物進(jìn)行分子對接，同時(shí)根據(jù)《中國支氣管哮喘防治指南》（2016 年版）推薦選擇常用藥β2 受體激動劑沙丁胺醇作為陽性對照藥物，以分子對接結(jié)合能來評價(jià)配體分子與受體分子的結(jié)合程度。一般認(rèn)為分子對接結(jié)合能的絕對值越大，化合物與靶點(diǎn)親和力越強(qiáng)，構(gòu)象越穩(wěn)定。絕對值大于4.25 表示具有一定的結(jié)合活性，大于5.0 表示具有較好的結(jié)合活性，大于7.0表示具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，分子對接結(jié)果見表1，關(guān)鍵藥效成分與核心靶點(diǎn)的最低結(jié)合能均大于5.0kcal/mol，且大于陽性對照藥物的結(jié)合能，說明這些成分與靶點(diǎn)之間均能夠穩(wěn)定的結(jié)合，選取結(jié)合能大于7.0kcal/mol 的對接結(jié)果利用Pymol 軟件繪圖，結(jié)果見圖7，分子對接結(jié)果提示5 個(gè)靶點(diǎn)中，MAPK8與豆甾醇的對接評分絕對值最大；靶點(diǎn)MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 分別與豆甾醇、異鼠李素、豆甾醇、豆甾醇、豆甾醇的親和力最強(qiáng)，提示豆甾醇可能是清肺飲治療支氣管哮喘的關(guān)鍵成分。由圖可見，槲皮素與MAPK8 在VAL-196、VAL-187、THR-178、ARG-150 處形成氫鍵；木犀草素與MAPK8 在LEU-302、TYR-266、ASP-305、CYS-245 處形成氫鍵，與ESR1 在LEU-387、THR-347 處形成氫鍵；異鼠李素與MAPK8 在GLU-109、MET-111 處形成氫鍵，與ESR1 在SER-527、CYS-417、SER-341、MET-343 處形成氫鍵；豆甾醇與MAPK8 在ASN-114、GLN-117 處形成氫鍵，與ESR1 在MET-358 處形成氫鍵，與IL6 在LEU-46 處形成氫鍵，與VEGFA 在GLU-103、TYR-25 處形成氫鍵。

表1 清肺飲活性成分、推薦藥物與支氣管哮喘核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

圖7 關(guān)鍵藥效物質(zhì)-核心靶點(diǎn)分子對接模式圖

3 討論

3.1核心成分的治療作用分析 本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建清肺飲的藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，得到活性成分133 個(gè)以及對應(yīng)靶點(diǎn)121 個(gè)。通過分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中度值排名前5 的活性成分發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)化合物中有4 個(gè)屬于黃酮類成分，豆甾醇屬于植物甾醇類物質(zhì)。研究證實(shí)，槲皮素可通過降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10 的表達(dá)量而達(dá)到抗炎癥的效果[6]。豆甾醇具有顯著抗炎作用，可顯著降低炎癥因子IL-6、IL-1、以及環(huán)氧合酶2 mRNA 表達(dá)，通過減少PGE2 和NO的釋放發(fā)揮其抗炎作用[7]。分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)之間均能夠穩(wěn)定的結(jié)合而且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定，表明這些成分可能為清肺飲治療支氣管哮喘的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)，其中，豆甾醇與四個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接評分絕對值最大，提示豆甾醇可能是清肺飲治療支氣管哮喘的關(guān)鍵成分。因TCMSP 數(shù)據(jù)庫中動物藥和礦物藥成分及靶點(diǎn)信息較少，因此未對處方中的石膏及僵蠶進(jìn)行成分及靶點(diǎn)的檢索，后期會通過文獻(xiàn)檢索的方式對相關(guān)信息進(jìn)行挖掘，以更全面地了解清肺飲的活性成分及靶點(diǎn)信息。

3.2核心靶點(diǎn)表達(dá)與支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，得到的14 個(gè)核心靶點(diǎn)主要涉及炎癥、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥等。其中MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 相關(guān)度最高，研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是參與支氣管哮喘發(fā)病及進(jìn)展的一條重要通路，通過調(diào)控免疫/炎癥細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，誘發(fā)支氣管哮喘[8]，IL-6 在支氣管哮喘發(fā)作期增高，病情緩解后逐漸恢復(fù)原水平，參與支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展的反應(yīng)過程，可以用來判斷支氣管哮喘的診治情況，評估支氣管哮喘的預(yù)后等[9]。EGFR 是通過與其相應(yīng)的配體結(jié)合，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的增殖和遷移，參與上皮細(xì)胞及組織纖維化的過程，進(jìn)而使氣道發(fā)生重塑，EGFR 的表達(dá)量主要在結(jié)構(gòu)性損傷區(qū)域增高，且增高程度與支氣管哮喘的嚴(yán)重性相關(guān)[10]。VEGFA 的大量表達(dá)，可以維護(hù)肺血管結(jié)構(gòu)、功能的正常及修復(fù)損傷等，進(jìn)而參與支氣管哮喘氣道重塑[11]。

3.3涉及主要信號通路與支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)分析本研究對交集靶點(diǎn)進(jìn)行了GO 功能富集和KEGG 通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清肺飲治療支氣管哮喘的生物過程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活、氧化還原過程、蛋白質(zhì)磷酸化等方面，說明清肺飲的平喘作用可能是一個(gè)復(fù)雜的多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。KEGG通路分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)主要富集于TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等與支氣管哮喘相關(guān)的通路，TNF 信號通路是介導(dǎo)炎癥和免疫損傷的重要通路之一，其中TNF-α 是其重要結(jié)合位點(diǎn)，通過活化下游NF-κB、Bcl-2 等蛋白激酶可激活NF-κB 信號通路，進(jìn)而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)[12]。PI3K-Akt 信號通路可以通過多種機(jī)制抑制小鼠氣道重塑，PI3K 在支氣管哮喘的發(fā)病過程中，能夠調(diào)Th細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而影響支氣管哮喘炎癥，發(fā)展參與支氣管哮喘的發(fā)病[13]。MAPK 在哺乳動物細(xì)胞中存在ERK、JNK、p38MAPK 等14 條信號通路，MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是參與支氣管哮喘發(fā)病及進(jìn)展的一條重要通路，通過調(diào)控免疫/炎癥細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，引起氣道高反應(yīng)和氣道重塑，造成Th1/Th2 免疫應(yīng)答失衡，最終誘發(fā)支氣管哮喘[8]。

總之，本研究基于清肺飲在治療支氣管哮喘的臨床有效性，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，結(jié)合分子對接對其潛在藥效成分、靶標(biāo)、通路進(jìn)行了研究，初步明確清肺飲與支氣管哮喘疾病之間的關(guān)系，并實(shí)現(xiàn)活性分子與靶點(diǎn)蛋白之間關(guān)系的可視化，揭示了清肺飲治療支氣管哮喘是多個(gè)活性成分通過多條途徑作用于多個(gè)靶點(diǎn)蛋白，符合中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。但是，目前的工作尚停留在虛擬篩選，只能為研究其作用機(jī)制提供參考，后續(xù)課題組擬設(shè)計(jì)動物實(shí)驗(yàn)，對清肺飲治療支氣管哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，從而更系統(tǒng)科學(xué)地闡明其藥理機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供更多參考。