基于網絡藥理學及分子對接技術研究澤漆萜類成分抗非小細胞肺癌作用機制

張麗蓉 樓燁亮 王 可 朱美曉

肺癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%以上，且轉移率和死亡率極高[1-2]。臨床治療肺癌多采用手術切除及化療手段，但患者生存質量較低。中醫辨證治療在干預癌前病變、預防腫瘤轉移、預防多藥耐藥等方面發揮重要作用[3]。澤漆（euphorbia helioscopia L.）為大戟科大戟屬植物，研究表明，澤漆可通過抑制腫瘤細胞生長增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移及腫瘤血管形成等機制，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中發揮抗腫瘤活性[4-6]。澤漆化學成分以萜類成分為主且表現出良好的抗腫瘤活性[7]。但澤漆萜類成分抗腫瘤作用靶點及機制未明確。因此本研究利用網絡藥理學及分子對接工具，對澤漆萜類成分抗NSCLC 的作用機制進行研究，以期為澤漆的臨床使用和進一步研究提供依據。

1 研究方法

1.1澤漆活性成分篩選及靶點預測 文獻中檢索澤漆的萜類成分，并檢索其SMILES 編碼上傳至Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平臺進行篩選，以胃腸道吸收程度（GI absorption）=“high”、Druglikeness項下多于2 個“Yes”為篩選條件即得澤漆活性成分合集。將上述篩選得到的活性成分上傳至Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺進行靶點預測，以“Probability*＞0”為條件進行篩選即得澤漆活性成分靶點合集

1.2NSCLC 相關靶基因的獲取 以“None-small cell Lung cancer”為關鍵詞分別在Gene cards 和CTD 中檢索肺癌相關靶基因。將從Gene cards 中獲得的NSCLC 靶基因按“Relevance score＞10”進行篩選；CTD中獲得的NSCLC靶基因按“Inference Score”從大到小進行排序，選取排名前200 位的靶基因[8]。將兩個數據庫所得到的靶基因進行歸納整理，即得NSCLC 靶基因合集。將活性成分靶基因合集點與NSCLC 靶基因進行相互映射，獲得澤漆活性成分-NSCLC 共同作用靶基因，并繪制Venn 圖，即得澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點及潛在作用成分。

1.3活性成分-肺癌靶點網絡構建 根據澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點及潛在作用成分，歸納整理，所得數據導入到Cytoscape 3.6.1 軟件中進行網絡構建，建立澤漆萜類活性成分-NSCLC 靶點網絡。

1.4PPI 網絡構建及網絡拓撲分析 將澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點導入STRING（https://string-db.org/）平臺進行蛋白互作分析，設置參數：物種“Homo sapiens”，相互作用閾值=0.400，其余參數默認。將獲得的相互作用數據導出，并應用Cytoscape 3.6.1 軟件中進行拓撲網絡分析，并繪制PPI 網絡圖。

1.5GO 分類與KEGG 通路富集分析 將PPI 網絡拓撲分析得到的核心靶蛋白導入DAVID 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）中，進行基因本體（GO）分類富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分類富集分析包括分子功能分析、生物學過程分析、細胞組分分析，研究藥物靶點主要信號通路，物種均設為“Homo sapiens（人類）”。以P＞0.05 為條件進行篩選，并各選取前20 條繪制氣泡圖（不足20 條的全部選取），最后，將分析得到的靶點、信號通路相對應，運用Cytoscape 3.6.1 軟件構建靶點-信號通路網絡模型。

1.6分子對接驗證 整理PPI 網絡中篩選得到的核心靶蛋白，利用autodock vina 對上述基因與可作用于這些基因的活性成分進行半柔性分子對接。Vina半柔性分子對接后的結合能越低，表明活性成分與靶點存在相互作用的可能性越大，通常以結合能小于-5.0kJ/mol 為標準，選取結合能最高和最低的對接結果進行展示。

2 結果

2.1澤漆抗肺癌活性成分篩選 在文獻中檢索澤漆萜類成分，共獲得85 個萜類成分，包括71 個二萜酯類、10 個三萜類及4 個倍半萜類。Swiss ADME 平臺中預測后得澤漆萜類活性成分共49 個，包括45 個二萜酯類及4 個倍半萜類（見表1）。

表1 澤漆萜類活性成分

2.2澤漆抗肺癌靶點篩選 將篩選得到的49 個活性成分上傳至Swiss Target Prediction 平臺中進行預測，刪除重復靶基因后共得中配對得到484 個靶基因。Gene Cards 和CTD 中獲得的NSCLC 靶基因篩選整理共得到1071 個靶基因。將澤漆活性成分靶基因與肺癌靶基因相互映射共得到107 個基因（見圖1），表明澤漆可能通過這107 個靶基因起到治療NSCLC 的作用。

圖1 澤漆萜類成分-NSCLC 交集靶基因VENN 圖

2.3澤漆萜類成分-NSCLC 靶點網絡構建 根據篩選到的107 個澤漆萜類成分治療NSCLC 靶點以及靶點與成分之間的關系，建立活性成分-抗肺癌靶點網絡圖（見圖2）。該網絡中包含154 個節點及600 條邊，包含47 個活性成分節點及107 個靶點節點，節點越大表示度值越大；600 條邊代表了活性成分與NSCLC 靶點間的相互作用。由Fig 2 可知，澤漆47種萜類活性成分作用于相同或不同的靶點，體現了澤漆多成分、多靶點治療NSCLC 的特點；根據節點的大小以及度值的高低，度值排名靠前的成分分別是euphohelioscopin B（degree=36）、euphornin K（degree=35）、euphornin A（degree=35）、euphoscopin A（degree=35）及euphoscopin E（degree=34），構建這5種活性成分與靶點相互作用的網絡（見圖3），表明這5 種成分可能是澤漆萜類成分中治療NSCLC 的關鍵成分。

圖2 澤漆萜類成分-NSCLC 靶點網絡

圖3 澤漆萜類成分-NSCLC 靶點核心網絡

2.4PPI 網絡及網絡拓撲分析結果 應用STRING平臺對澤漆治療NSCLC 的靶蛋白進行蛋白互作分析并應用Cytoscape 初步構建了一個包含107 個節點和1584 條邊的PPI 網絡A。應用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree＞45 進行第一次篩選后構建網絡B，以Betweenness＞16 進行第二次篩選后構建網絡C，其過程見圖4。第二次篩選后得到的網絡圖中度值較大的靶蛋白分別是STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，度值均為15，這些靶點與其他靶點關聯密切，可能在治療NSCLC 的重要靶點。

圖4 PPI 網絡拓撲分析結果

2.5GO 分類及KEGG 信號通路富集分析 將PPI網絡第二次篩選后得到的16 個蛋白靶點上傳至DAVID 6.8 平臺進行富集分析，共得到211 條GO條目，包括155 條BP（生物過程），19 條CC（細胞組分）及37 條MF（分子功能）。以P 值排序，選取排名分別選取前20 條繪制氣泡圖（見圖5）。結果顯示，生物過程主要涉及PI3K 信號轉導的調控、序列特異性DNA 結合轉錄因子活性的調控、凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化及基因表達的正向調控等；細胞組分主要涉及細胞質、細胞核、細胞核漿、蛋白質復合體及質膜等；分子功能主要涉及酶結合、激酶活性、轉錄因子結合、蛋白結合及MAP 激酶活性等，GO 分類富集結果表明澤漆萜類成分是通過多種生物學過程而發揮治療NSCLC 的作用。

圖5 GO 功能富集結果

KEGG 富集共得到84 條信號通路，以P 值排序，選取排名分別選取前20 條繪制桑吉氣泡圖（見圖6）。主要涉及的信號通路主要有ErbB 信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路及多種癌癥通路等，調控腫瘤細胞的增殖、生長、侵襲及凋亡等過程，表明澤漆萜類成分可通過多條信號通路發揮治療NSCLC 的作用。

圖6 KEGG 信號通路富集結果

2.6靶點-信號通路網絡 將排名前20 位的信號通路與靶點相對應，歸納整理，導入Cytoscape 中構建“靶點-信號通路”網絡（見圖7），網絡中共包括36 個節點和164 條邊，其中20 個橙色三角形為信號通路節點，16 個綠色圓形為靶點節點，表明澤漆萜類成分可能通過多靶點、多信號通路而發揮治療NSCLC 的作用。網絡中，靶點節點中排名前5 的靶點分別是MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，分別調控了多條信號通路，表明這5 個靶點可能是澤漆萜類成分中發揮治療NSCLC 作用的關鍵成分。

圖7 澤漆萜類成分抗NSCLC 靶點-信號通路網絡

2.7分子對接驗證結果 PPI 核心網絡中的關鍵蛋白為STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，靶點-信號通路網絡中的核心基因為MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，結合2.3 項下獲得的關鍵活性成分，利用autodock vina 對上述基因與可作用于這些基因的活性成分進行半柔性分子對接，見表2，結果顯示活性成分與其對應的靶點分子對接結合能均小于-5.0kJ/moL，表明活性成分與靶點具有較好的結合活性，證明本文的預測結果較為可靠。選取結合能最低（Mol30 與SRC）和最高（Mol37 與PIK3CA）的對接結果進行展示，見圖8。

圖8 分子對接結果展示

表2 分子對接結果

3 討論

本文基于網絡藥理學，整合多個數據平臺對澤漆萜類成分治療NSCLC 的可能作用機制進行研究，通過構建漆萜類活性成分-NSCLC 靶點網絡，明確澤漆萜類成分中的euphohelioscopin B、euphornin K、euphornin A、euphoscopin A 及euphoscopin E 為主要活性成分，但暫未檢索到目前有針對該幾種成分的藥理研究，缺乏實驗研究佐證，后續將主要對這5種成分的抗NSCLC 作用進行深入研究。

PPI 網絡拓撲分析及靶點-信號通路網絡結果顯示，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR 可能是澤漆萜類成分發揮抗NSCLC 作用的關鍵靶點。MAPK3（ERK1）與MAPK1（ERK2）同屬于MAPK 通路下游中重要的靶標[9]，目前基本認為ERK1 與ERK2的生物學功能類似[10]。臨床檢測肺癌等多種腫瘤組織ERK1 高表達[11]，肺癌組織ERK1/2 通路失調，且在腫瘤的侵襲和轉移中起關鍵作用[12-13]。EGFR 是NSCLC中最常見的驅動基因，EGFR 基因突變可增強TK 活性，且當EGFR 與配體結合后可激活下游信號通路，促進腫瘤細胞增殖進而促進腫瘤進展[14-15]。臨床上已有多種EGFR 靶向抑制劑應用于NSCLC 的治療[16]。PIK3CA 在肺癌組織中也存在突變及過度擴增的現象[17]。EGFR 與PIK3CA 的突變往往導致AKT 的突變及過度活化，促進肺癌進一步惡化[18]。CCND1 在G1/S 期細胞周期轉換中起著重要的作用，當其在NSCLC 腫瘤組織呈現高表達的狀態時，腫瘤細胞可加速細胞周期進程引起細胞的快速增殖[19-20]。以上結果表明，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR可能是澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點。

GO 分類和KEGG 富集分析結果顯示，澤漆萜類成分抗NSCLC 作用的生物學過程主要涉及PI3K 信號轉導的調控、序列特異性DNA 結合轉錄因子活性的調控、凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化及基因表達的正向調控等，通過調控ErbB 信號通路、HIF-1信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路，調控腫瘤細胞的增殖、生長、侵襲、凋亡及腫瘤組織血管生成等發揮治療NSCLC 的作用。

最后對篩選得到的活性成分及靶點進行分子對接驗證，結果顯示，澤漆萜類活性成分與相對應的作用靶點均展現出較好的親和力，且結合位點均有穩定的氫鍵，構象穩定，有強烈的結合能力，進一步驗證了本研究預測的準確性，也表明澤漆萜類成分可能通過多成分作用于多靶點發揮治療NSCLC 的作用。

綜上所述，本研究通過對澤漆萜類成分抗NSCLC 作用靶點的生物過程及信號通路進行富集分析，明確了澤漆萜類成分抗NSCLC 作用的分子機制具有多成分、多靶點、多途徑的特點。這為后續實驗驗證提供了研究思路，而澤漆萜類成分研究較少，本研究所預測到的5 種主要活性成分均無藥理研究先例，后續將對此進行深入研究。