LYRM2表達通過調控糖酵解代謝影響結腸癌RKO細胞增殖、侵襲

黃 琦，吳婧婧，彭 瑤，李 娜，王年飛

結直腸癌是胃腸道常見的腫瘤之一。近年，全球結直腸癌發病率、病死率顯著提升。2020年全球結直腸癌總發病率上升至第3位，病死率上升至全球癌癥死亡原因的第2位[1]。因此，發現新的介導結直腸癌惡性轉化的調控分子有望為控制結直腸癌的發展提供靶點，對提高結直腸癌患者的生存具有重要的臨床價值，也是亟待解決的問題。有研究顯示，腫瘤代謝過程的干預是實現腫瘤防治的新手段，具有較好的抑制效果[2-3]。本組前期實驗發現，在結直腸癌中高表達的LYRM2分子可通過Akt-LYRM2-Comlplex Ⅰ代謝軸在結直腸癌細胞氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)代謝中發揮重要作用[4]。因此，本文著重探討LYRM2對結腸癌糖酵解代謝的調控機制，為LYRM2作為結腸癌的潛在治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑人結腸癌細胞系RKO購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，培養于含10%FBS的RPMI 1640完全培養基中。LYRM2過表達載體L2HA(對照為CHA載體)和LYRM2干擾載體SH1KD(對照為GPH載體)及相應的慢病毒顆粒購自上海英為信公司(因LYRM2抗體效果不佳，構建L2HA、CHA載體中加入HA標簽便于蛋白水平驗證轉染成功，CHA為帶有HA標簽的對照空載體，GPH為對照空載體)；RPMI 1640培養基、胎牛血清等購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海李記公司；Transwell試劑盒購自北京康寧公司；Seahorse XF糖酵解壓力測試試劑盒購自美國Agilent公司；細胞乳酸含量檢測試劑盒、代謝酶活性檢測試劑盒，均購自北京索萊寶公司。

1.2 腫瘤細胞慢病毒轉染轉染前24 h，將對數生長期的RKO細胞以2×105個/孔鋪至24孔板中，細胞匯合度約50%。按病毒轉染試劑盒說明書進行操作。SH1KD ShRNA序列：5′-TGATGATTACT CAAGGCAATA-3′。

1.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖按2 000個/孔的細胞量重復接種至6塊96孔板中，更換10 μL CCK-8+100 μL新鮮培養基的混合液(避免產生氣泡)，680型酶標儀檢測450 nm處的吸光值。每24 h檢測1塊96孔板，連續檢測6天。

1.4 細胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力劃痕實驗：將5×106個/孔細胞接種至6孔板中，待匯合度達80%～90%時，移除培養基，超凈臺中用200 μL的移液槍頭劃3條直線，分別于0 h和培養48 h后拍照。Transwell實驗：基質膠和無血清培養基按1 ∶5稀釋、混勻(冰浴上操作)，取100 μL于上室，37 ℃孵育4～5 h至凝固。取100 μL密度為1×104/mL重懸于無血清培養基的細胞鋪于上室，下室加入含15%FBS的培養基，37 ℃孵育24 h。經10%中性福爾馬林固定，0.1%結晶紫染色15 min，PBS沖洗2次，棉棒輕柔擦除小室上表面細胞。顯微鏡觀察小室下層穿過的細胞數，隨機計數5個視野。

1.5 海馬(Seahorse)細胞能量檢測按(1.0～1.5)×104個/孔細胞種植于海馬細胞培養板，每孔約80 μL，于培養基中培養過夜。每孔加入200 μL校正液到Sensor Cartridge中，于無CO2的37 ℃培養箱中水化過夜。更換培養基，加入基礎測試液潤洗細胞3次，最終維持每孔175 μL，于無CO2的37 ℃培養箱中培養1 h。配制檢測過程中需加入的藥物：10 mmol/L 葡萄糖、1 μmol/L寡霉素、50 mmol/L 2-DG。將矯正后的Cartridge板每個加藥孔中加入相應藥物25 μL。機器中矯正平衡30 min后運行檢測。完成后計數各孔細胞，標準化最終檢測結果，得到各組細胞糖酵解代謝水平。進一步基于Wave軟件轉化、計算得出各組細胞ATP含量(單位定義為每分鐘104個細胞產生的ATP含量)。

1.6 細胞乳酸含量檢測按試劑盒說明書溶解、配制各試劑。按50×104個細胞：1 mL提取液混勻細胞，冰浴超聲波破碎細胞，4 ℃、12 000g離心10 min后取上清。按試劑盒說明書順序加樣各試劑后，于分光光度計檢測、計算細胞乳酸含量，具體溶劑配制，計算公式參考說明書，單位定義為104個細胞的產生乳酸量。

1.7 細胞代謝酶活性檢測HK2、PK、PHK、LDH按試劑盒說明書溶解、配制各試劑。收集細胞至離心管中，按50×104細胞：1 mL提取液混勻細胞，冰浴超聲波破碎細胞，4 ℃、8 000g離心10 min后取上清。按說明書順序加樣各試劑后于分光光度計檢測、計算各代謝酶活性。具體溶劑配制、計算公式參考試劑盒說明書。單位U定義：每1×104個細胞每分鐘生成1 nmoL NADPH定義為1個酶活力單位。

2 結果

2.1 LYRM2過表達、敲低結腸癌細胞系的構建及驗證利用LYRM2過表達載體L2HA和干擾載體SH1KD構建穩轉LYRM2過表達及敲低結腸癌細胞系。mRNA表達驗證：轉染L2HA的RKO細胞LYRM2的mRNA表達(167.10±3.73)顯著高于對照CHA細胞(8.79±0.17)，差異有統計學意義(P<0.001)；轉染SH1KD的RKO細胞LYRM2的mRNA表達(1.13±0.11)顯著低于對照GPH細胞(11.51±0.82)，敲低率達90%，差異有統計學意義(P<0.01，圖1A)。利用HA標簽抗體進行Western blot實驗，結果證實LYRM2蛋白在RKO細胞中成功轉染，穩定表達(圖1B)。

圖1 LYRM2過表達及敲低細胞系mRNA及蛋白水平驗證：A. mRNA表達；B.蛋白表達；***P<0.001

2.2 LYRM2差異表達對RKO細胞增殖的影響CCK-8實驗顯示：LYRM2過表達L2HA細胞的增殖比對照CHA細胞顯著加快，尤其在第6天，LYRM2過表達L2HA細胞的吸光度是對照CHA細胞的1.53倍[OD450 nm：(1.83±0.08)vs(1.20±0.09)，P<0.001]；第6天LYRM2敲低SH1KD細胞的增殖速率比對照GPH細胞顯著降低[OD450 nm：(0.82±0.07)vs(1.35±0.09)，P<0.01，圖2]。

圖2 LYRM2差異表達對RKO細胞增殖的影響：***P<0.001

2.3 LYRM2差異表達對RKO細胞遷移能力的影響細胞劃痕實驗顯示：LYRM2過表達L2HA細胞隨時間延長遷移速度顯著高于對照CHA細胞，在48 h遷移距離分別為(46.67±0.33) μm和(28.33±0.33) μm；LYRM2敲低的SH1KD細胞在48 h遷移距離僅約(3.67±0.33) μm，顯著低于對照GPH細胞(27.67±0.33) μm，差異有統計學意義(P<0.001，圖3)。

圖3 LYRM2差異表達對RKO細胞遷移能力的影響

2.4 LYRM2差異表達對RKO細胞侵襲能力的影響Transwell實驗顯示：LYRM2過表達的L2HA細胞侵襲數目(941.70±39.55)比對照CHA細胞(469.30±21.53)明顯增多；LYRM2敲低的SH1KD細胞侵襲數目(87.00±9.29)比對照GPH細胞(504.30±3.48)明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.001，圖4)。

圖4 LYRM2差異表達對RKO細胞侵襲能力的影響

2.5 LYRM2差異表達對RKO細胞糖酵解代謝的影響Seahorse實驗檢測不同LYRM2表達RKO細胞的糖酵解代謝水平；通過細胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)檢測細胞的胞外產酸能力，間接顯示糖酵解能力。在不同時間點分別加入高濃度葡萄糖、寡霉素(ATP合酶抑制劑)和2-DG(糖酵解抑制劑)檢測在不含葡萄糖或丙酮酸的糖酵解壓力測試培養基中培養細胞的糖酵解水平。結果顯示：LYRM2過表達的L2HA細胞糖酵解代謝水平顯著高于對照CHA細胞，LYRM2敲低SH1KD細胞糖酵解水平明顯低于對照GPH細胞，差異有統計學意義(P<0.001，圖5)。計算細胞ATP含量與細胞糖酵解結果一致，表現為LYRM2過表達L2HA細胞ATP含量高(5.68±0.39) pmoL，LYRM2敲低SH1KD細胞ATP含量低(1.71±0.09) pmoL，分別與對照CHA、GPH細胞相比，差異均具有統計學意義(P<0.001)。各組細胞內乳酸生成量：LYRM2過表達L2HA細胞內乳酸含量(66.70±0.87) nmoL比對照CHA細胞(10.08±0.12) nmoL明顯增加(P<0.001)，LYRM2敲低SH1KD細胞內乳酸含量(6.02±0.10) nmoL比對照GPH細胞(9.65±0.20) nmoL明顯減少(P<0.01，圖6)。

2.6 LYRM2差異表達對RKO細胞代謝酶活性的影響腫瘤組織糖酵解關鍵代謝酶包括HK、PFK異構體和PK。檢測不同LYRM2表達的RKO細胞內各糖酵解關鍵代謝酶活性：LYRM2高表達L2HA細胞內HK2活性為(0.126±0.002) U，顯著高于對照CHA細胞HK2活性(0.098±0.002) U；LYRM2低表達SH1KD細胞內HK2活性為(0.076±0.002) U，顯著低于對照GPH細胞HK2活性(0.099±0.002) U，差異均有統計學意義(P<0.001)。各LYRM2差異表達的RKO細胞中，PFK和PK酶活性差異無統計學意義(圖7)。

圖5 LYRM2對RKO細胞糖酵解代謝的影響：ECAR.細胞外酸化率

圖6 LYRM2表達對RKO細胞內ATP及乳酸生成的影響：A. ATP；B.乳酸；**P<0.01，***P<0.001

3 討論

LYRM2位于6號染色體，編碼約10.4×103大小的蛋白質。目前，有關LYRM2的研究有限。本組前期實驗發現LYRM2蛋白主要定位于線粒體，在結直腸癌中可通過與Complex Ⅰ結合參與Complex Ⅰ活性的調控，對結直腸癌細胞OXPHOS代謝有顯著調節作用[4]。

腫瘤細胞為維持不受控的迅速增殖，需要大量的能量及營養物質。糖酵解因其產能速率明顯快于線粒體OXPHOS而被腫瘤細胞主要利用。當腫瘤細胞的糖酵解代謝被抑制時，OXPHOS會代償性增加以維持腫瘤細胞的存活及增殖，這種腫瘤細胞適應性的調整其代謝途徑的行為稱為腫瘤細胞的可塑性[5-6]。在氧氣充足的條件下，腫瘤細胞依賴有氧糖酵解和OXPHOS雙重代謝供能，不同腫瘤細胞的差異在于糖酵解和OXPHOS產能比例不同，一些腫瘤細胞中OXPHOS產能普遍超過40%，在某些特殊細胞中如MCF-7，這一比例可高達80%[7]。越來越多的證據表明，代謝的改變與腫瘤的惡性轉化密切相關[8]。目前，腫瘤的特征在經歷Hanahan等[9]的三代更新后，“細胞能量代謝的異常調控”仍作為腫瘤的十四大特征之一，其始終作為腫瘤進展中的核心問題。研究提示腫瘤代謝過程的干預是實現腫瘤治療新的手段之一，如果能夠同時性阻斷腫瘤細胞糖酵解代謝和OXPHOS代謝可能成為治療腫瘤的新策略。本組前期實驗已證實，LYRM2對結直腸癌細胞的OXPHOS代謝具有重要的調控作用；本組發現LYRM2表達對結腸癌RKO細胞糖酵解代謝也具有顯著影響：LYRM2高表達促進RKO細胞糖酵解代謝，LYRM2低表達抑制RKO細胞糖酵解代謝。對糖酵解代謝過程限速酶活性分析發現：LYRM2高表達增強RKO細胞內HK2活性，LYRM2低表達抑制RKO細胞內HK2活性。由此，作者推測LYRM2可能通過調控結腸癌RKO細胞糖酵解過程限速酶HK2的活性參與糖酵解代謝調節，進一步影響RKO細胞的增殖、遷移及侵襲表型。

基于LYRM2定位于線粒體，參與線粒體Complex Ⅰ活性調節，作者查閱文獻發現，Complex Ⅰ對于誘導糖酵解，維持細胞的增殖存活至關重要[10-13]。功能正常的Complex Ⅰ可以誘導缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表達，繼而激活細胞糖酵解，并激活相關致瘤通路。當Complex Ⅰ功能失調，線粒體內多種參與三羧酸循環的關鍵酶包括α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復合體等受到影響，線粒體內α-酮戊二酸的累積促使HIF-1α的降解，即使在無氧條件下也不能誘導糖酵解的發生[10-11]。這可能是LYRM2表達誘導糖酵解代謝改變的間接機制。本組通過酶活實驗證實，LYRM2表達對糖酵解代謝限速酶HK2的活性產生影響，這可能是LYRM2誘發糖酵解代謝改變的直接通路，但需進一步探索及驗證。

圖7 LYRM2表達對RKO細胞內代謝酶活性的調節：A.HK2；B.PFK；C.PK；***P<0.001，ns.差異無統計學意義

研究顯示結直腸癌中HK2蛋白水平上調，與腫瘤大小、侵犯深度、肝臟轉移及腫瘤分期等顯著相關，且HK2高表達與患者復發及總病死率增加密切相關，HK2高表達是結直腸癌患者的獨立預后因素[14-15]。靶向HK2的治療已提示具有較好的抑制結直腸癌進展的效果[16-18]。結直腸癌細胞HK2敲低后，細胞的乳酸生成量、增殖速率及遷移能力均明顯下降，同時對5-氟尿嘧啶化療敏感性增加[19]。即便如此，糖酵解調控酶活性受腫瘤微環境變化的影響，單一靶點抑制不足以抑制腫瘤增殖，多靶點聯合治療可能為更好的選擇?？傊琇YRM2作為同時參與調控結腸癌細胞OXPHOS和糖酵解代謝分子，可能為結腸癌的治療提供新靶點。