甲酸脫氫酶和甲醛脫氫酶異源表達及協同催化降解甲醛的研究*

莫 易，彭 念，陳雨點，李 倩，劉文書，李勇昊

(重慶科技學院化學化工學院，工業發酵微生物重慶市重點實驗室(重慶科技學院)，重慶 401331)

甲醛是建筑材料中常見污染物，被我國列為第二位優先控制的有毒化學品[1]。致癌和致畸作用是甲醛對人體健康造成危害的主要因素[2]。據報道長期(>1年)處于甲醛(0.107± 1.694)mg/m-3環境會增加淋巴細胞微核細胞率[3]。我國已頒布《室內空氣質量標準》(GB/T18883-2002)，規定甲醛最大允許濃度為0.08 mg/m-3[4]。因此開發降解甲醛的方法勢在必行。

目前甲醛處理方法主要包括物理吸附和光催化，但仍存在需要特定反應條件、低效率及不環保等缺點。近年來植物和微生物的生物酶催化甲醛降解被認為是具有應用前景的替代技術[5]。Kondo T等[6]分離到一株可完全消耗0.45%甲醛濃度的真菌；牛成潔等[7]利用甲醛降解菌開發了室內甲醛凈化設備；然而從自然界中分離降解甲醛微生物所需工作量大，且要保證菌株次級代謝產物對人無害，因此利用基因工程手段理性表達甲醛降解關鍵蛋白具有一定優勢。張婧等[8]將FADH和FDH固定到聚丙烯酰胺上發現對甲醛有吸附效果，但該研究并未具體表征FDH對FADH降解甲醛效果的影響。

本研究將惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)來源FADH和博伊丁假絲酵母菌(Candidaboidinii)FDH基因經密碼子優化后克隆到pET26b載體，轉化到蛋白酶缺陷菌株EscherichiacoliER2566并嘗試利用IPTG誘導T7啟動子表達兩種生物酶，最后探討FDH對FADH降解甲醛效率的影響，預期研究成果對實現高效且環保降解甲醛提供參考。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒與菌株

蛋白酶缺陷感受態E.coliER2566購自上海唯地生物技術有限公司，克隆菌株E.coliDH5α和表達載體pET26b由作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

質粒抽提試劑盒(B518191)、DNA膠回收試劑盒(B518131)、SDS-PAGE試劑盒(C631100)、異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨，生工生物工程(上海)股份有限公司；His標簽蛋白純化試劑盒(P2226)，上海碧云天生物技術有限公司；DNA marker(TSJ011)，北京擎科生物科技有限公司；甲醛測定試劑盒(090380)，廣東環凱微生物科技有限公司；甲醛溶液，分析純，重慶川東化工(集團)有限公司。LB培養基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L和酵母提取物5 g/L。

1.1.3 儀器與設備

ZWY-240型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SCQ-1500F超聲波破碎儀，上海聲彥超聲波儀器有限公司；iMark吸收光酶標儀，美國Bio-rad公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5811臺式冷凍大容量離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體構建

惡臭假單胞菌fadh基因(GenBank：D21201)和博伊丁假絲酵母fdh基因(GenBank：O13437)進行密碼子優化后，fadh基因通過HindⅢ和SalI酶切位點連入pET26b中，fdh經NdeⅠ和XhoⅠ連接到pET26b；載體構建在E.coliDH5α，質粒測序正確后轉入E.coliER2566表達。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達及純化

單克隆菌株在5 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB培養基中37 ℃過夜活化，1%接種量至50 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB培養基中37 ℃，180 r/min培養至OD600為0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導4 h后發酵液在4 ℃，6000 r/min離心6 min，棄上清。用磷酸鹽緩沖液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)洗滌菌體，離心后重懸于30 mL緩沖液進行超聲破碎。條件為300 W，破碎3 s停止5 s，共20 min。離心取上清為粗酶液，過Ni柱得到純化的FADH和FDH蛋白，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達和純度。

1.2.3 甲醛降解分析

50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1 mg/L甲醛，1 mmol/L NAD+，加入一定量的重組蛋白混合物于3 mL的反應體系中，置于 40 ℃溫育24 h后通過1.1.2所述試劑盒測定甲醛濃度。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

蛋白表達載體如圖1所示，圖1A和B分別為表達FADH和FDH蛋白的質粒圖，可知質粒為卡那霉素抗性，利用T7啟動子表達基因，且在蛋白碳端具有組氨酸標簽，后續可以使用Ni柱純化蛋白；圖1C為質粒驗證電泳圖，fadh和fdh基因大小分別為1197 bp和1092 bp，電泳條帶與預計大小相符，進而測序結果證明堿基無突變。后續可以使用IPTG誘導相應基因表達。

M： DL2000 marker; 1： FADH; 2： FDH圖1 重組載體的驗證Fig.1 Verification of recombinant vectors

2.2 重組蛋白的表達與純化

發酵粗酶液及純化蛋白經SDS-PAGE電泳檢測結果如圖2所示。圖2A中條帶1是野生菌ER2566發酵的粗酶液，條帶2是重組菌ER2566-FADH發酵的粗酶液，條帶3是重組菌ER2566-FADH的純化蛋白，說明FADH成功在E.coliER2566中異源表達并純化。圖2B中條帶1是野生菌ER2566發酵的粗酶液，條帶2是重組菌ER2566-FDH發酵的粗酶液，條帶3是重組菌ER2566-FDH的純化蛋白，說明FDH蛋白成功在E.coliER2566中異源表達并純化。FADH和FDH重組蛋白相對分子質量均約為45 kD，與理論推定值相符。FADH的大小與景愛霞等[9]在大腸桿菌中表達甲基營養菌 MP688的結果(55 kD)有一定差別，分析原因主要是使用基因不同。FDH的大小與張婧等[8]報道的結果(45 kD)相似。

圖2 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達水平和純化程度Fig.2 SDS-PAGE to detect the expression level and purification degree of recombinant protein

2.3 FADH與FDH對甲醛降解效果分析

將純化后的FADH和FDH對甲醛降解效果進行分析。如 圖3所示，初始的溶液甲醛濃度為1 mg/L， 1 μg FDH重組蛋白處理后溶液的甲醛濃度減少了0.009 mg/L，甲醛濃度幾乎沒有變化， 說明FDH作為酶具有專一性，不具備降解甲醛的能力；2.8 μg FADH重組蛋白處理后溶液的甲醛濃度為0.924 mg/L，甲醛濃度下降了7.6%；2.8 μg FADH和1 μg FDH重組蛋白混合物處理后溶液的甲醛濃度為0.479 mg/L，甲醛濃度下降了52.1%，比張婧等[8]用固定化的FADH和FDH降解甲醛的效率(40%)有所提高，說明提高FADH與FDH比例可以提高甲醛降解效率。使用FADH和FDH重組蛋白混合物降解甲醛效率是FADH的6.8倍，證明FDH重組蛋白雖然不能降解甲醛，但可以顯著提高FADH對甲醛的降解效果。這可能是因為FDH的存在使甲酸降解為二氧化碳，低濃度的甲酸導致FADH降解甲醛的反應向正反應方向移動，從而提高了降解甲醛的效率，同時無甲酸污染。

圖3 重組蛋白降解甲醛效果(t-text***P<0.001)Fig.3 Recombinant protein degradation effect of formaldehyde

3 結 論

本文成功利用Escherichiacoli異源表達且純化出有活性的甲醛脫氫酶(FADH)和甲酸脫氫酶(FDH)。FADH可以有效降解甲醛，降解量為0.076 mg/L，在體系中加入FDH后降解甲醛效率提高了5.8倍。本研究為開發環保降解甲醛試劑和設備提供了參考。