HPLC法測定南方紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ和金松雙黃酮含量*

凌子懿，吳澤君，包 敏，唐小鵬，肖人鐘，丁 野

(1 株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000；2 湖南天大生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410136；3 湖南省藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410136)

紅豆杉始見于《本草綱目》，記載其可以治療霍亂、傷寒，在我國藥用歷史悠久。南方紅豆杉來源為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的帶葉枝條，其藥材或飲片為廣東、湖北、浙江、上海、安徽等省市中藥材標準或中藥飲片炮制規范所收載，藥用部位均為帶葉干燥枝條，功效為消腫散結、通經利尿，用于治療腫瘤、糖尿病、腎病、類風濕關節炎、水腫、風濕痹病等癥。現代研究表明，紫杉醇、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ等紫杉烷類成分具有抗癌活性[1-2]，金松雙黃酮、銀杏雙黃酮等黃酮類成分具有抗腫瘤、降脂、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗骨質疏松病等多種藥理作用[3-6]，為南方紅豆杉主要活性成分?！逗笔≈兴幉馁|量標準》2018年版、《上海市中藥飲片炮制規范》2018年版等現行南方紅豆杉藥材和飲片質量標準僅收載了10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量測定項目，無黃酮類成分質量控制指標。本實驗采用高效液相色譜法同時測定南方紅豆杉藥材中紫杉烷類主成分10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、黃酮類主成分金松雙黃酮的含量，并對湖南、江西、福建等不同產地、不同品種的南方紅豆杉含量進行考察，為南方紅豆杉藥材及飲片的質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

儀器：美國Waters-E2695型高效液相色譜儀、Empower色譜工作站，美國沃特世公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XSE205DU電子分析天平，梅特勒托利多有限公司。

藥材：南方紅豆杉藥材共16批，其中普通品種樣品10批，藥用型優樹品種樣品6批。經株洲市食品藥品檢驗所吳澤君主任藥師鑒定為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的帶葉枝條。

試劑：10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(批號：PRF20031626，含量：98%)成都普瑞法科技開發有限公司；金松雙黃酮(批號： PRF9110541；含量：98%)成都普瑞法科技開發有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；實驗用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，以甲醇為流動相A，乙腈為流動相B，0.1%冰醋酸為流動相C，進行梯度洗脫，見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：232 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2 對照品溶液的制備

取10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成單一對照品貯存液，精密量取單一對照品貯存液適量，加無水乙醇制成10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ濃度為216.0 μg·mL-1、金松雙黃酮濃度為200.9 μg·mL-1混合對照品儲備液，備用。

2.3 供試品溶液及空白溶液的制備

取藥材粉末(過四號篩)0.2 g，精密稱定，置錐形瓶，加入無水乙醇25 mL，超聲45 min，放冷，再稱定重量，加無水乙醇補足重量，過濾，取續濾液即得供試品溶液。不加供試品，同法操作，即得空白溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

精密吸收對照品儲備液適量，用無水乙醇稀釋制成10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ濃度為0.8640、2.160、4.320、10.80、21.60、43.20、216.0 μg·mL-1，金松雙黃酮濃度為0.8036、2.009、4.018、10.04、20.09、40.18、200.9 μg·mL-1系列溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標，對照品溶液峰面積(Y)縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮回歸方程分別為Y=7871.5X-3649.7， r=0.9999，Y=1523.6X+7755.3， r=0.9997，線性范圍分別為0.8640～216.0 μg·mL-1，0.8036～200.9 μg·mL-1。結果表明2種成分在相應濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 檢出限及定量限

取2.2項下對照品溶液逐級稀釋，按2.1項下色譜條件測定，以信噪比(S/N)為3所對應的濃度為檢測限，信噪比(S/N)為10所對應的濃度為定量限。10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ檢出限為0.14 μg·mL-1，定量限為0.43 μg·mL-1，金松雙黃酮的檢出限為0.20 μg·mL-1，定量限為0.67 μg·mL-1。

2.4.3 精密度考察

取同一混合對照品溶液，連續進樣6次，按照2.1項下色譜條件測定，結果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮峰面積的RSD分別為0.36%，0.61%，表明儀器精密度良好(n=6)。

2.4.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，12，24 h按2.1項下色譜條件測定，結果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的面積的RSD分別為0.75%，0.58%。表明供試品在24 h內穩定(n=6)。

2.4.5 重復性試驗

取同一南方紅豆杉樣品6份，按照2.3項下操作，制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的質量分數的RSD分別為0.79%、0.72%，表明方法重復性良好(n=6)。

2.4.6 加樣回收率

取已知含量南方紅豆杉樣品0.1 g，精密稱定，共6份，分別加入一定量10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮對照品溶液，按2.3項下制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表2。表明方法準確性良好。

表2 回收率試驗(n=6)Table 2 Recovery rate test(n=6)

2.5 樣品測定

取16批樣品，按照2.3項下操作，制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算含量，結果見圖1和表3。

1.10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ；2.金松雙黃酮圖1 溶劑空白(A)、混合對照品(B)和 南方紅豆杉藥材樣品(C)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of solvent blank(A)， mixed reference substances(B)and sample of Taxuschinensis var. mairei ramulus et folium(C)

表3 南方紅豆杉含量測定結果Table 3 Determination results of contents in Taxus chinensis var. mairei

3 討 論

3.1 提取方法的優化

本實驗考察了甲醇、無水乙醇、甲醇∶丙酮(3∶1)3種提取溶劑，超聲提取(30、45、60 min)、回流提取(1.0、1.5、2.0 h)2種提取方法。結合樣品中2種待測成分的提取率及提取效率，確定樣品提取方法為超聲提取，提取溶液為無水乙醇，提取時間為45 min。

3.2 檢測波長及流動相選擇

本實驗采用二極管陣列檢測器對2種待測成分在200～ 400 nm波長范圍掃描，考察待測成分的紫外吸收光譜。結果10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在227 nm、232 nm波長處有較強吸收峰，金松雙黃酮在232 nm、330 nm波長處較強吸收峰。綜合考慮溶劑的截止使用波長、樣品中雜質的干擾以及2種成分的吸收強度，確定232 nm作為檢測波長。10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ為紫杉烷類生物堿，金松雙黃酮為黃酮類雙黃酮成分，2種成分極性差異很大。本實驗以甲醇、乙腈、水、0.1%冰醋酸4種溶劑作為流動相組分，進行不同組合的等度或梯度洗脫考察。結果以本實驗采用的甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸作為流動相，梯度洗脫， 2種成分與鄰峰分離度好，分析周期最短。

3.3 不同產地及南方紅豆杉樣品中成分含量的差異

本實驗對不同產地、品種南方紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的含量進行了測定研究，結果顯示普通品種中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量明顯低于藥用型優樹品種，金松雙黃酮含量差異不大；不同產地相同品種的南方紅豆杉樣品中2種成分含量無明顯差異。故宜選用藥用型優樹品種作用南方紅豆杉藥材和飲片的植物來源。

4 結 論

綜上所述，本方法操作簡單，精密度、穩定性、重復性好，可用于南方紅豆杉藥材及中藥飲片的質量控制。