洗手液抑菌率測試的影響因素探究

俞 婕 潘 衛 李凱利 黃濤杰 蔡國強, 何一波,*

1.納愛斯浙江科技有限公司，浙江杭州，310051；2.浙江省綠色清潔技術及洗滌用品重點實驗室，浙江麗水，323000

近年來，具有抑菌效果的洗手液產品受到越來越多消費者的青睞。抑菌率測試是目前諸多企業作為評價日化產品抑菌性能的重要方法之一。GB 19877.1－2005《特種洗手液》中對具有抑菌效果的洗手液提出了相應的質量要求，當抑菌率≥50%時，方可標識為抑菌產品[1]。同時，標準中指出抑菌率測試方法主要按照GB 15979-2002《一次性衛生用品衛生標準》附錄C進行，若由于產品配方體系因素，該檢測方法不適用時，可參照《消毒技術規范》（2002年版）或國家省級以上政府部門頒布的規范性方法檢驗。以往經驗表明，產品的抑菌率測試結果容易受到測試樣品濃度、菌株來源、試樣與菌液的作用時間、測試溫度等條件因素的影響，有些甚至與配制樣品溶液的水硬度有關聯。然而，GB 19877.1－2005《特種洗手液》中只指出了樣品測試濃度和作用時間，而對于測試溫度等信息并未作出詳細規定。GB 15979－2002和《消毒技術規范》相應的抑菌率測試方法中也未對測試溫度等因素進行控制。在另一份標準文件QB/T 2738－2012《日化產品抗菌抑菌效果的評價方法》7.3抑菌型日化產品的抑菌效果檢驗方法（懸液定量法）部分對日化產品在開展抑菌率測試前有對樣品進行20 ℃（皂類30 ℃）恒溫5 min的操作[2]，同時該文件中也提到對待測樣品進行稀釋時均采用342 mg/L標準硬水。測試溫度、配制樣品的水硬度等條件因素對洗手液抑菌率結果是否會產生影響？另外標準方法中提到的不同編號的大腸桿菌（ATCC 25922和8099）是否也會產生差異？本文因此開展探索，旨在明確洗手液抑菌率測試的干擾因素，精確控制測試條件，以提高測試結果的重現性。

1 實驗材料與設備

1.1 樣品

實驗樣品為實驗室自制抑菌洗手液樣品和購買于大型超市的宣稱具有抑菌性能的洗手液樣品，購買及自制洗手液時盡量選取配方差異較大的樣品，共計10款，將這些樣品分別編號為XSY-1至XSY-10。

1.2 試劑

0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）2.83 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.36 g，蒸餾水1 000 ml；0.5%吐溫80-PBS緩沖液：0.5 g吐溫80，PBS 100 ml；硬水（硬度250 mg/L）：氯化鈣（CaCl2）0.167 g，六水氯化鎂（MgCl2·6H2O）0.203 7 g，蒸餾水1 000 ml；硬水（硬度342 mg/L）：氯化鈣（CaCl2）0.304 g，無水氯化鎂（MgCl2）0.065 g，蒸餾水1 000 ml；營養瓊脂培養基，廣東環凱。

試驗菌株為1株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC 6538），購自于菌種保藏中心G；2株大腸桿菌Escherichia coli（8099），分別購自于菌種保藏中心G和菌種保藏中心C；1株大腸桿菌Escherichia coli（ATCC 25922），購自于菌種保藏中心G。購買到的菌種經活化、轉接培養至第5代時進行測試。

1.3 儀器

松下MVS-83高壓蒸汽滅菌鍋，?，擜R320彩屏紅外線測溫儀，IKA KS400 ic控溫搖床，IKA RC 2 basic恒溫器，IKA ROLLER 10 digital滾動搖床，IKA VORTEX 3旋渦混勻器，Binder KB240恒溫培養箱，METTLER ME3002E電子天平，Eppendorf移液器（1～10 ml，100～1 000 μl，10～100 μl），Thermo ECO1.8超凈工作臺。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

在50 ml無菌PET瓶內，用蒸餾水或指定硬度的無菌水將洗手液樣品按1∶1（w∶w）濃度配制成溶液，于滾動搖床上以80 r/min轉速滾動混勻10 min以上，待樣品完全溶解并混勻后用移液槍分裝于滅菌玻璃試管中，每管5 ml，將試管置于不同溫度的控溫搖床中恒溫，使樣品溶液的溫度達到目標溫度后方可進行抑菌測試。

2.2 抑菌測試

抑菌測試方法參考GB 15979－2002《一次性衛生用品衛生標準》附錄C4溶出性抗（抑）菌產品抑菌性能試驗方法[3]進行，作用時間為2 min[1]。每一項測試均進行3次，最終以3次結果的平均值作為最終數據。測試過程中均設置陽性對照組和陰性對照組，其中陽性對照組以PBS代替樣品溶液，陰性對照組以PBS代替菌懸液，并以硬水（或純水）代替樣品溶液。

3 實驗結果

3.1 兩種常規菌種的抑菌率測試

將10 款洗手液樣品分別對金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸桿菌（8099，保藏中心G）兩種較為常規的菌種進行抑菌率測試。由于GB 15979－2002中未明確規定配制樣液的水硬度及測試溫度，因此測試時參考QB/T 2738－2012，采用了342 mg/L硬水配制待測樣液，而測試溫度為25 ℃±1℃。測試3次結果平均值已在表1中列出，且2種菌的陽性對照組均有菌落生長，陰性對照組未長菌。表1的測試結果表明，測試樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌率均可達到＞99.99%，而對大腸桿菌的抑菌率參差不齊。為了便于對比研究，后續選取大腸桿菌作為本次研究的主要測試菌株。

表1 10款市售和自配洗手液樣品的抑菌率 單位：%

3.2 不同來源菌株對抑菌率的影響

在GB 15979－2002中，編號為ATCC 25922和8099的大腸桿菌均可作為測試菌株。不同編號的菌株意味著菌株的來源不同，從菌種保藏中心G的官網了解到，編號為ATCC 25922的菌株溯源地是美國，標注的是質控菌株，編號為8099的菌株溯源地是中國，標注的是消毒殺菌質控菌株。同時，從另一家菌種保藏中心C也購買到了編號為8099的大腸桿菌，其溯源地也是中國，更詳細的是軍事醫學科學院，標注的是消毒測試菌株。為了比較不同來源的菌株在生物活性、對化學物的抵抗力方面是否會存在差異，在保持測試條件一致（342 mg/L硬水配制待測樣液，測試溫度25 ℃±1 ℃）的情況下追加了10款洗手液對保藏中心G購買的大腸桿菌（ATCC 25922）和保藏中心C購買的大腸桿菌（8099）的測試。

測試3次結果平均值已在表2中列出，且陽性對照組均有菌落生長，陰性對照組未長菌。表2的抑菌率對比結果顯示，除了XSY-2/-4/-6/-9這4個樣品對3個菌株的抑菌率均穩定地維持在＞99.99%外，其余6個樣品對不同來源的大腸桿菌抑菌率存在不同程度差異。從XSY-1/-3/-5/-7/-8/-10的結果來看，保藏中心G和保藏中心C的大腸桿菌（8099）雖然在菌株編號上相同，但抑菌率差異較大，其中保藏中心G的抑菌率結果均低于保藏中心C。從XSY-1/-3/-5/-8/-10的結果來看，雖然菌株編號不同，但保藏中心C的大腸桿菌（8099）與保藏中心G的大腸桿菌（ATCC 25922）的抑菌率較為接近。

表2 來自不同菌種保藏中心的大腸桿菌（8099）抑菌率 單位：%

3.3 水硬度對抑菌率的影響

GB 15979－2002未對配制洗手液的水硬度做出明確規定。本文借鑒了日化產品抑菌率和洗滌測試的相關標準，選取了342 mg/L[2]和250 mg/L[4]的硬水，以0 mg/L的超純水作為對照，分別配制成洗手液溶液后測試對大腸桿菌（8099，保藏中心G）的抑菌率，測試溫度為25 ℃±1 ℃。測試3次結果平均值已在表3中列出，且陽性對照組有菌落生長，陰性對照組均未長菌。從表3結果中可以看出，除了XSY-2/-4/-6在3個硬度條件下的抑菌率結果均＞99.99%外，其余樣品的抑菌率隨著水環境硬度的提高有輕微上升，但上升幅度較小。

表3 10款洗手液在不同硬度條件下的大腸桿菌（8099）抑菌率 單位：%

3.4 測試溫度對抑菌率的影響

若無明確要求，樣品測試往往是在室溫下進行，因此樣品的測試溫度與實驗室溫度較為接近。本文利用恒溫設備分別設置了三個溫度條件，將樣品、菌液和稀釋液等測試過程中涉及的液體分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃的溫度下，待液體溫度平衡至相應溫度后，以大腸桿菌（8099，保藏中心G）為菌株進行抑菌率測試。圖1展示了每個樣品3次抑菌率平均值，并以柱狀圖形式將每個樣品在三個溫度下的抑菌率進行了比較。另外測試結果中陽性對照組有菌落生長，陰性對照組未長菌。圖1中的結果顯示，一部分樣品在三個溫度下抑菌率始終保持于＞99.99%水平（如XSY-2/-4/-6）；一部分樣品在溫度從20 ℃變化至25 ℃時抑菌率有不同程度的提升，有的提升率較?。ㄈ鏧SY-10），有的提升率較大（如XSY-9）；而有一部分樣品在20 ℃和25 ℃溫度下抑菌率較為接近，但在30 ℃下抑菌率有較為明顯的提升（如XSY-1/-3/-5/-8）。從結果中可以發現，溫度對洗手液抑菌率結果會產生較大程度的影響，且對不同配方體系的產品，溫度的影響程度也會存在差異。

圖1 不同溫度下洗手液抑菌率變化情況

3.5 影響金黃色葡萄球菌懸液計數的影響因素

在金黃色葡萄球菌的測試過程中發現在玻璃試管內進行測試時，空白對照組的菌含量較預期明顯偏少。經過排查，發現采用不同材質容器、不同稀釋液對菌液計數結果的影響較大。設計了4個方案分別對同一瓶菌懸液進行10倍系列稀釋及菌落計數，計數結果由表4所示，當采用玻璃試管和PBS緩沖液（方案A）進行計數時，菌液濃度被明顯低估，當采用PET材質試管（方案B）或使用含有0.5%吐溫80的PBS緩沖液（方案C），或同時采用時（方案D），菌液濃度均明顯提升且較為接近。

表4 不同計數方案下的金黃色葡萄球菌懸液的濃度

4 討論與分析

從10款洗手液的測試結果可以發現，洗手液對不同菌種的抑菌效果存在差異，所有樣品對金黃色葡萄球菌（ATCC 6538，保藏中心G）的抑菌效果較好，部分樣品對大腸桿菌（8099，保藏中心G）的抑菌效果較弱，有的甚至沒有抑菌效果。這一現象可能與細菌的細胞膜結構有關，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性（G+）菌的代表，大腸桿菌是革蘭氏陰性（G-）菌的代表，G+菌和G-菌在細胞膜的結構和成分上存在顯著差異，前者雖然細胞壁較厚，但僅有一層細胞質膜，后者細胞壁較薄，但在細胞壁的外側和內側分別有外膜和細胞質膜這兩層膜[5]，與此同時兩者細胞膜上的蛋白、脂質等成分也有所不同。目前市面上洗手液中添加的抑菌成分主要有苯扎氯銨、水楊酸、對氯間二甲苯酚、葡萄糖酸氯己定、O-傘花烴-5-醇等，這些成分對細菌的作用機制在一定程度上與改變或破壞細菌細胞膜結構有關[6]，從而進一步引起菌體胞漿物質外滲等結果。菌體細胞膜結構的不同勢必會影響到抑菌成分對細菌的作用效率，因此對不同細菌的抑菌率會產生差異。不同來源的大腸桿菌在抑菌率的測試結果上也表現出差異性。購自不同菌種保藏中心的2個大腸桿菌菌株編號雖然都是8099，但部分洗手液對2個菌株的抑菌率差異較大。而購自不同保藏中心且編號不同的菌也有可能表現出較為一致的抑菌率結果。由此可以推斷，同一個菌種，當其來源不同時，即使遺傳物質及生化反應相同，在抵抗化學物質抑殺方面的能力可能是有差異的。因此，建議企業和檢測機構在抑菌率測試報告中注明菌株編號及來源，以利于后期研發人員或者消費者了解到更加詳細的測試信息，從而避免因菌株來源不同而造成的抑菌性能錯估。

此外，測試結果發現測試溫度和配制樣品的水硬度對抑菌率的測試結果產生了一定的影響，其中測試溫度的影響較為明顯，而水硬度的影響相對較小。測試溫度對于抑菌率的影響至今鮮有文獻資料報道，推測溫度上升加速了抑菌成分對細菌細胞膜的破壞作用，從而提高了抑菌效率。水硬度對于抑菌率的影響也同樣少有報道，張亦琳等[7]研究發現在紅薯葉總黃酮提取中引入Ca2+和Mg2+可明顯提高紅薯葉總黃酮的抑菌活性，但對其機制尚未明確闡述。抑菌測試的實驗操作步驟雖然并不復雜，但目前配制樣品的水硬度和測試溫度在洗手液抑菌測試的標準方法中沒有做出明確的規定，因此建議企業和檢測機構在測試不同批次樣品期間，將這兩個因素納入控制范圍，以提高測試結果的重現性。另外，金黃色葡萄球菌懸液用玻璃試管和PBS緩沖液稀釋計數時菌數大幅減少的原因尚不明確，且同時測試的大腸桿菌懸液不存在該現象，可能是金黃色葡萄球菌菌體與玻璃試管產生了一定的附著。Katsuyama等[8]研究發現，金黃色葡萄球菌非常容易利用纖維蛋白纖維、多糖等物質形成生物膜結構，在孵育5 min后開始就出現纖維蛋白纖維，30 min后已形成較為致密的纖維蛋白網，并有大量的菌體附著在上面。

5 結論

目前的洗手液抑菌率測試標準中未對測試溫度、配制樣品的水硬度等條件作出明確規定。本文對不同菌種、菌株來源、測試溫度、水硬度等因素是否會影響抑菌率測試結果開展研究，結果顯示洗手液對不同菌種的抑菌效果差異明顯，菌株來源、測試溫度、水硬度這3個因素對抑菌率均會產生不同程度的影響，具體影響程度因樣品的配方不同會表現出差異，因此在進行洗手液抑菌測試過程中需盡量控制并標明測試信息，以提高測試結果的重現性和可比性。另外，采用不同的溶液和容器配制金黃色葡萄球菌懸液也會令實驗空白組的菌液計數結果產生差異，也需引起一定的注意。