大黃素對脂多糖刺激下肺泡Ⅱ型上皮細胞表達促凝及纖溶抑制因子的調節作用

鄭興昊 李清 沈鋒 楊貴霞 李想 肖川

1貴州醫科大學附屬醫院重癥醫學科（貴陽 550004）；2貴州中醫藥大學第二附屬醫院麻醉科（貴陽 550002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）基本病理改變為肺泡毛細血管損傷、肺水腫及后期的肺組織纖維化等[1]。頑固性低氧血癥是引起ARDS相關性多器官功能障礙（MODS）及死亡的重要原因。研究[2-3]表明，在ARDS疾病中存在肺泡促凝亢進和纖溶抑制，引起肺血管內廣泛微血栓、肺泡大量纖維蛋白沉積，導致肺泡死腔增多、通氣血流比例（V/Q）失調等，引起ARDS頑固性低氧血癥[4-5]。因此，針對上述改變，研究有效藥物，有望改善ARDS治療結局。大黃素（Emodin，ED）是天然的蒽醌衍生物[6]，被廣泛應用于治療流感、敗血癥等疾病[7-10]。既往研究[11-13]表明，ED能通過抑制NF-κB信號通路減輕肺損傷。筆者前期研究發現，ED能有效改善LPS引起的ARDS肺泡過度促凝和纖溶抑制狀態，抑制肺組織過度炎癥反應，具有較好肺保護作用[14]，但它的作用機制不清楚。而肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）對肺泡纖溶抑制及促凝有非常重要的調控效用[15]。本文以AECⅡ為主要研究對象，觀察ED對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下該細胞中促凝和纖溶抑制相關因子的影響，探索該藥作用環節。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑選用大鼠AECⅡ細胞株（中南大學細胞庫），LPS、ED（Sigma公司）；組織因子（TF）一抗（美國 NOVUS公司），3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗（中國武漢），組織因子途徑抑制劑（TFPI）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）一抗和二抗（美國 Abcam），TFPI、PAI-1、TF引物序列（中國上海）；凝血酶抗凝血酶復合物（TAT）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）及APC的ELISA試劑盒（上海）。

1.2 實驗分組及處理將傳代培養的AECⅡ細胞分為5組。正常對照（NC）組：不做任何處理常規培養；LPS組：參考前期研究方法[15]對細胞進行LPS處理；不同劑量ED組：加入ED 0.25、0.5及1 μg/mL處理細胞1 h，然后加入LPS繼續培養24 h。

1.3 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8）篩選ED的最佳濃度取AECⅡ細胞懸液加入96孔板，細胞貼壁后加入不同濃度的ED溶液并培養24 h。換液后加入10%CCK-8溶液10 μL，培養箱中孵育4 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度（A），計算細胞存活率。選取與空白組相近細胞活力的ED濃度作為研究濃度。

1.4 Western blotting檢測 TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達收集處理完畢的細胞，裂解細胞，高速低溫離心，收集上清液，按Western blotting檢測試劑盒操作說明檢測TF、TFPI、PAI-1蛋白表達。實驗重復3次，取均值。

1.5 RT-qPCR檢測AECⅡ細胞中TF、TFPI、PAI-1的mRNA表達收集處理完畢的細胞，加入Trizol裂解液裂解，離心；根據RT-qPCR方法進行操作。選用2-ΔΔCt法計算所需基因的表達量。

1.6 ELISA檢測上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP的水平取一定量的AECⅡ細胞上清液，根據試劑盒說明書進行檢測，測定A值時選用波長450 nm的酶標儀，選取標準曲線計算得到AECⅡ細胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平。

1.7 統計學方法采用Graphpad Prism9.0軟件作圖并統計學分析；符合正態分布的數據，計量資料使用均數±標準差，組別間的比較選用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時組別間的均數間兩兩比較使用 SNK-q（Student-Newman-Keuls）檢驗法，當方差不齊時使用Tamhane's T2檢驗法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法篩選ED的最佳濃度如圖1所示，分別予0.25、0.5、1、2、4 μg/mL 5個 ED濃度培養細胞后進行CCK-8檢測，結果顯示當ED濃度達到1 μg/mL后細胞增殖呈逐漸下降趨勢，故選1 μg/mL的劑量濃度作為后續實驗研究的最高劑量。

圖1 CCK8實驗中各組AECⅡ細胞的活性Fig.1 Activity of AECⅡcells in each group in CCK8 experiment

2.2 ED劑量依賴性改善AECⅡ細胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表達使用LPS刺激以后，細胞中TF和PAI-1的蛋白表達量顯著增加，TFPI蛋白表達顯著減少（均P＜0.05）。ED劑量依賴性逆轉了PAI-1、TF和TFPI的蛋白改變（均P＜ 0.05）（圖2，表1）。

圖2 蛋白質免疫印跡試驗（Western blotting）檢測各組大鼠AECⅡ細胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表達Fig.2 The protein expressions of PAI-1，TFPI and TF in AECⅡcells were detected by Western blotting

表1 各組AECⅡ細胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達比較Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

表1 各組AECⅡ細胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達比較Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

注：NC組是正常對照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED組、M-ED組、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05；與M-ED組比較，d P＜0.05，F為兩個均方的比值（效應項/誤差項）

樣本數（個）3 3 3 3 3組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值TF/GAPDH 0.25±0.02 0.80±0.02a 0.57±0.01ab 0.46±0.01abc 0.38±0.01abcd 728.3＜0.000 1 TFPI/GAPDH 0.59±0.01 0.31±0.03a 0.40±0.01ab 0.45±0.02ab 0.51±0.04ab 52.52＜0.000 1 PAI-1/GAPDH 0.31±0.03 0.85±0.04a 0.63±0.08ab 0.52±0.04ab 0.45±0.01ab 56.28＜0.000 1

2.3 ED劑量依賴性改善AECⅡ細胞PAI-1、TF、TFPI的mRNA表達使用LPS刺激AECⅡ細胞后其TF和PAI-1的mRNA表達量顯著增加，TFPI mRNA表達量顯著減少（均P＜0.05）。使用不同劑量ED培養的細胞TF和PAI-1的mRNA表達量都較LPS組劑量依賴性減少，TFPI劑量依賴性增加（P＜0.05），如表2所示。

表2 各組AECⅡ細胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表達比較Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

表2 各組AECⅡ細胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表達比較Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

注：NC組是正常對照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED組、M-ED組、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05；與M-ED組比較，d P＜0.05，F為兩個均方的比值（效應項/誤差項）

組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值樣本數（個）3 3 3 3 3 TF 0.45±0.01 2.47±0.02a 2.00±0.01ab 1.36±0.07abc 1.02±0.06abcd 1072＜0.000 1 TFPI 1.00±0.06 0.26±0.01a 0.51±0.02ab 0.62±0.01abc 0.70±0.02abcd 261.0＜0.000 1 PAI-1 1.00±0.04 2.63±0.01a 2.39±0.03ab 2.06±0.04abc 1.84±0.10abcd 367.9＜0.000 1

2.4 ED劑量依賴性改善AECⅡ細胞上清液中TAT、AT-Ⅲ、APC及PⅢP水平LPS刺激后，AECⅡ細胞上清液中AT-Ⅲ、APC水平顯著少于NC組，PⅢP、TAT水平顯著多于NC組（均P＜0.05）。ED劑量依賴性逆轉了上述因子的水平（均P＜0.05），如表3所示。

表3 各組AECⅡ細胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比較Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

表3 各組AECⅡ細胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比較Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

注：NC組是正常對照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED、M-ED、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05，F為兩個均方的比值（效應項/誤差項）

組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值樣本數（個）3 3 3 3 3樣本數（個）3 3 3 3 3 APC（ng/mL）1 421.80±40.49 998.19±8.95a 1 095.85±4.53ab 1 234.42±26.37abc 1 296.48±47.2abc 88.96＜0.000 1 TAT（ng/mL）9.93±0.40 17.69±0.23a 13.85±0.72ab 13.36±0.89abc 11.80±0.37ab 72.09＜0.000 1 AT-Ⅲ（ng/mL）131.41±2.16 77.72±2.77a 90.85±3.24ab 114.42±3.70abc 118.94±3.21abc 153.2＜0.000 1 PⅢP（ng/mL）185.50±1.27 280.81±10.99a 241.48±9.35ab 221.44±5.52abc 214.31±4.29ab 74.50＜0.000 1

2.5 ED對細胞核內p65表達的影響為了觀察大黃素預處理對LPS刺激下細胞核內p65表達，我們使用免疫熒光法測定細胞核中p65水平。結果如圖3所示，ED預處理明顯降低了細胞核內p65蛋白熒光染色。

圖3 AECⅡ細胞核中p65的檢測Fig.3 Detection of p65 in the nucleus of AECⅡ

3 討論

本實驗采用既往LPS濃度（5 μg/mL）刺激肺泡上皮細胞[16]，模擬革蘭陰性桿菌誘導ARDS細胞模型。通過LPS刺激AECⅡ細胞后，使得其PAI-1、TF的表達水平均明顯升高，TFPI表達水平則明顯降低；細胞上清液中ATⅢ、APC含量均明顯減少，PⅢP、TAT含量則明顯增加，與我們前期結果一致[15-16]。ED預處理AECⅡ細胞，可明顯抑制LPS刺激引發的TF、PAI-1表達增加，促成TFPI表達；另一方面又可明顯減少細胞上清液中PⅢP、TAT水平，增加APC、AT-Ⅲ含量。提示ED能有效逆轉LPS刺激引起的促凝和纖溶抑制因子的變化。

TF是較強的促凝因子，其異常表達在血栓形成、動脈粥樣硬化和急性冠脈綜合征等凝血疾病中起重要作用[17-18]。TFPI是TF的生理抑制劑，通過抑制TF-FVIIa復合物形成來抑制TF誘導的凝血[19-20]。PAI-1是主要的纖溶抑制劑，抑止纖維蛋白溶解從而增加纖維蛋白沉積[21]。ATⅢ由SerpinC1基因編碼[22]，與內皮細胞表面的肝素樣物質相互作用起抗凝作用。蛋白C的活性形式為APC，具有強大的抗凝血活性[23]。TAT 代表凝血酶生成量，可用于評估機體的凝血激活狀態[24]。機體組織纖維化的程度則是通過PⅢP反映的，它的變化決定了體內纖維組織的含量[25]。本研究提示，ED預處理明顯抑制了LPS刺激下AECⅡ細胞表達及分泌纖溶抑制因子和促凝，而增加抗凝因子的水平，提示ED具有糾正LPS刺激下AECⅡ細胞促凝和纖溶抑制因子表達的失衡，與我們前期結果相符合[14]。本文結果還表明AECⅡ細胞是ED作用靶點之一。免疫熒光提示LPS刺激導致細胞核中p65蛋白熒光染色增強，表明LPS刺激促進了p65的核移位。ED卻顯著降低了細胞核內p65蛋白水平，提示該藥的作用與抑制NF-κB信號通路有關。

本研究事先通過CCK-8確定了ED的安全劑量范圍。因此，可排除藥物本身對細胞的毒性作用。在所選取的劑量范圍內，隨著劑量增大，ED的作用逐漸增加，提示該藥的作用效果可能存在一定劑量依賴關系。本實驗的不足：（1）基礎實驗和臨床應用存在一定的差異，本研究通過LPS刺激[13]AECⅡ細胞對纖溶和凝血反應得到的結果不一定完全與臨床相符，因此還需更深入的臨床研究證實；（2）對于ED劑量的選擇可進一步優化；（3）對于ED的作用機制未能明確說明。

綜上所述，ED在一定程度上抑制了LPS刺激下Ⅱ型肺泡上皮細胞表達及分泌纖溶抑制因子和促凝的能力，該作用可能與其抑制NF-κB信號通路活化有關。