METTL3介導IGF2BP3 m6A修飾對兒童肝母細胞瘤細胞增殖、遷移的影響

魏慧珍 允文晶 崔西春

鄭州大學第一附屬醫院1兒童重癥監護室，2綜合重癥監護室，3小兒外科（鄭州 450000）

肝母細胞瘤是目前臨床中較為常見的在胚胎時期已經發生的祖細胞腫瘤，也是目前主要兒童腫瘤之一[1]。現階段雖然采用化療方案和手術技術對肝母細胞瘤患者進行干預可有效改善患者生存率，但患者的臨床預后質量仍相對較差[2]。因此，積極尋找和探尋導致肝母細胞瘤發生和發展的分子機制，為選擇合理有效的臨床治療靶標和預后評價標志物具有十分重要的意義[3]。有學者指出，表觀遺傳修飾與腫瘤的識別高度相關，并可與多種分子生物學機制研究密切相關[4]。研究結果表明，在腫瘤的發生和發展過程中核糖核酸（RNA）靶向修飾具重要生物學意義[5]。N6-腺苷酸甲基化（m6A）在多種信使RNA（mRNA）內部修飾和信號轉導過程中扮演重要角色，并與腫瘤發生和演進高度相關。此外，在不同腫瘤基因組亞型或背景中m6A修飾扮演不同角色[6]。m6A甲基轉移酶復合物中METTL3起到重要的調控作用，并可有效調節mRNA降解和翻譯以及RNA穩定性[7]。但在兒童肝母細胞瘤中METTL3介導IGF2BP3 m6A修飾的作用仍鮮有報道，因此，筆者通過分析METTL3介導IGF2BP3 m6A修飾對兒童肝母細胞瘤細胞增殖、遷移的影響，為臨床治療應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 方法采用qRT-PCR檢測小兒肝母細胞瘤HuH-6（購買自ATCC公司）中METTL3和IGF2BP3 mRNA的表達；Western blot檢測METTL3和IGF2BP3蛋白表達（抗體購買自CST公司）。通過慢病毒轉染，在HuH-6細胞中敲低METTL3，并通過免疫印跡驗證METTL3蛋白表達，采用qRT-PCR與Western blot檢測IGF2BP3的表達，m6A甲基化RNA免疫沉淀技術分析IGF2BP3 mRNA m6A修飾的情況；CCK-8和Transwell小室實驗檢測細胞增殖及遷移能力。

1.1.1 sgMETTL3載體構建利用CRISPR-sgRNA設計網站設計METTL3基因外顯子sgRNA序列，合成上游（5'-CACCGCACTGGGCTGTCACTACGGA-3'）和下游（5'-AAACTCCGTAGTGACAGCCCAGTGC-3'）基因序列，制備雙鏈DNA，通過BsmB I對lenti-CRISPR V2載體行后續的酶切、回收操作，并進行連接。通過測序獲得正確的lenti-CRISPR V2-sgMETTL3質粒。質粒交由通用生物科技有限公司合成和測序。

1.1.2 METTL3低表達細胞系建立參照文獻方法進行慢病毒包裝，后曝光293FT細胞，病毒包裝質粒ps PAX2、病毒膜蛋白質粒pMD2.G，lentiCRISPR v2-sgMETTL3質粒或lentiCRISPR v2質粒混合均勻，后采用磷酸鈣轉染法進行處理，轉染后收集加入HuH-6細胞培養基，后加入嘌呤霉素2 μg/mL行抗性篩選，篩選1周后的lentiCRISPR v2-sgMETTL3和lentiCRISPR v2穩定細胞系。后將所有細胞分為空載體組和sgRNA組進行處理。

1.1.3 m6A甲基化RNA免疫沉淀采用TRIzol抽提細胞RNA后打斷RNA，RNA片段與m6A抗體復4℃孵育4 h，室溫與磁珠孵育2 h，漂洗4次，洗脫m6A抗體并富集RNA。

1.1.4 免疫沉淀利用RIPA Buffer裂解液裂解細胞，后超聲破碎，4℃下采用IGF2BP2抗體、磁珠、IgG抗體孵育30 min，磁珠抗體孵育2 h，漂洗6次，洗脫IGF2BP3結合復合物，抽提RNA。

1.1.5 qPCR檢測逆轉錄制備cDNA，采用qPCR MIX試劑盒（THUNDER BIRD）檢測目的基因。利用CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀檢測，預變性60 s、95℃，變性10 s、95℃，退火延伸30 s、60℃，共持續40個循環。METTL3基因、IGF2BP3基因、GAPDH基因、IGF2BP3 m6A甲基化基因和GAPDH m6A甲基化基因引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成提供。

1.1.6 Western blot檢測RIPA細胞裂解液抽提總蛋白，采用SDS-PAGE法分離總蛋白，后電轉至PCDF膜，后采用5% BSA封閉1 h，后在4℃條件下一抗孵育過夜，TBST洗滌4次，每次10 min，后室溫條件下使用二抗孵育1 h，采用ECL顯影液采集數據。

1.1.7 免疫熒光染色培養細胞爬片24 h，室溫4%多聚甲醛固定15 min，室溫通透10 min（0.5% Triton X-100），室溫下5% BSA封閉1 h，室溫一抗孵育2 h，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，DPAI室溫下孵育5 min，后封片采集數據。

1.1.8 細胞劃痕檢測6孔板接種細胞后在底部畫橫線4條，采用PBS洗滌每孔3次并將漂浮細胞去除后加入無血清培養基2 mL，并置于細胞培養箱中培養，0、24、48 h時使用顯微鏡拍照并計算。

1.1.9 Transwell實驗12孔板置入Transwell小室，采用基礎培養基制備細胞懸液，后在Transwell小室上室中進行接種，在下室加入完全培養基，并置于培養箱中24 h，后甲醛固定，甲醇通透，結晶紫染色，使用顯微鏡拍照并計算。

1.1.10 細胞增殖檢測使用無血清培養基制備細胞懸液，后接種在96孔板中并置于細胞培養箱中培養48 h和72 h，后利用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，采用酶標儀在450 nm處檢測光密度值。

1.2 統計學方法本研究使用Graphpad和SPSS 20.0統計學軟件包行統計學分析，采用百分率表示計數資料并行χ2檢驗分析數據資料差異，計量資料利用均值±標準差表示并行LSD-t檢驗和方差檢驗分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 METTL3敲低細胞系檢測本組研究結果顯示，采用METTL3 sgRNA干預后會顯著降低細胞METTL3表達水平，且差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1及圖2。

圖1 METTL3蛋白表達水平檢測結果Fig.1 Detection Results of METTL3 Protein Expression Level

圖2 免疫熒光染色檢測結果Fig.2 Results of immunofluorescence staining

2.2 各組細胞增殖結果本組研究結果顯示，sgRNA組細胞48 h和72 h時細胞增殖水平明顯低于空載體組，且差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞增殖結果Tab.1 Investigation results of cell proliferation in each group ±s，%

表1 各組細胞增殖結果Tab.1 Investigation results of cell proliferation in each group ±s，%

組別空載體組sgRNA組復孔數3 3 48 h 65.84±4.43 43.95±5.02 72 h 73.29±4.19 48.91±3.23

2.3 各組細胞遷移與侵襲檢測結果本組研究結果顯示，sgRNA組細胞24 h和48 h時細胞遷移明顯低于空載體組，sgRNA組細胞侵襲水平明顯低于空載體組，見圖3及圖4。

圖3 各組細胞遷移檢測結果Fig.3 Cell Migration Test Results of Each Group

圖4 各組細胞Transwell檢測結果Fig.4 Transwell Test Results of Cells in Each Group

2.4 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結果本組研究結果顯示，sgRNA組細胞中IGF2BP3蛋白及mRNA表達水平明顯低于空載體組，且差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結果Tab.2 Detection Results of IGF2BP3 Protein and mRNA in Each Group ±s

表2 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結果Tab.2 Detection Results of IGF2BP3 Protein and mRNA in Each Group ±s

組別空載體組sgRNA組復孔數3 3蛋白0.64±0.08 0.21±0.04 mRNA 0.71±0.12 0.34±0.08

2.5 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結果本組研究結果顯示，sgRNA組細胞中m6A-IP及IGF2BP3 m6A相對表達量明顯低于空載體組，且差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結果Tab.3 IGF2BP3 m6A Modification Level Test Results ±s

表3 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結果Tab.3 IGF2BP3 m6A Modification Level Test Results ±s

組別空載體組sgRNA組復孔數3 3 m6A-IP/Input（%）1.02±0.14 0.63±0.08 IGF2BP3 m6A相對表達量1.03±0.09 0.57±0.08

3 討論

小兒肝母細胞瘤是現階段臨床中較為常見的嚴重惡性肝臟腫瘤之一，通常情況下該病患者多在出生后2年時發病，且臨床發病率約為百萬分之1.5左右，在全部兒童癌癥患者中約占1%左右，且近年來每年均呈現明顯的快速、持續增長狀態[8]。有學者指出，小兒肝母細胞瘤的組織學類型主要包括混合型、上皮型兩種[9]。研究發現，作為常見的散發性腫瘤，小兒肝母細胞瘤患者的三分之一患者可能存在家族性腺瘤性息肉病、貝克威斯。韋德曼綜合征、唐氏綜合征、Edward綜合征、腎母細胞瘤等均高度相關[10]。近年來，研究指出體質量較輕嬰兒臨床中罹患肝母細胞瘤的風險較高[11]。現階段臨床中小兒肝母細胞瘤患兒的臨床分期是對患者預后質量進行評估和判斷的關鍵因素，且5年低風險生存率約為80%，且復發或高風險后5年生存率降低30%左右[12]。因此臨床中尋找和探尋新的治療兒童肝母細胞瘤的生物標志物，具有十分重要的意義。

m6A修飾是現階段受到人們廣泛關注的重要轉錄后修飾方法，其中約60%左右RNA修飾通過m6A形式完成，該修飾方法也是最為主要和豐富的RNA修飾方案，且其序列中多存在高度保守的RRACH序列[13]。目前臨床中m6A修飾已成為主要和受到人們廣泛關注的表觀遺傳修飾新熱點。有研究指出RNA甲基轉移酶和去甲基化酶是調控m6A的主要方式，甲基轉移酶作為核心甲基化調節的關鍵蛋白，METTL3有效催化m6A形成。去甲基化酶包括FTO、ALKBH5等，其中還有包括HNRNPA2B1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3等負責識別m6A修飾蛋白[14-15]。

METTL3目前公認的可有效催化m6A功能蛋白的重要生物活性物質，有研究指出，METTL3在細胞內可有效催化RRACH出現m6A修飾[16-17]。METTL3廣泛分布在真核生物中并具高度保守性，METTL3具多種調控生物學功能的作用，早期胚胎會由于出現METTL3基因敲除而出現致死[18]。研究結果顯示，在哺乳動物胚胎發育中METTL3扮演十分重要的作用，并屬于生物調劑過程中扮演不可或缺角色[19]。有研究結果顯示，氧誘導視網膜病變模型中可通過將METTL3敲除后有效抑制角膜新生血管形成，結果顯示血管生成與METTL3緊密相關，許多生理和病理過程均與血管生存高度相關，包括傷口愈合、胚胎發育、腫瘤生長、組織再生[20]。在多種腫瘤的發生和發展過程中METTL3扮演十分重要作用，并可有效調節腫瘤細胞遷移和侵襲。

自首次發現m6A修飾依賴作用，相關研究也逐漸受到人們的廣泛關注，且在正常的生物發育過程中扮演十分重要角色，m6A修飾起到動態平衡的調節作用。RNA m6A修飾可有效通過m6A甲基轉移酶復合物執行，通過依賴Fe（Ⅱ）和αKG去甲基化酶有效去除后實現生理和病理條件m6A甲基化動態調節。作為m6A甲基轉移酶復合物催化中心，METTL3以YTHDF2依賴促進細胞信號因子抑制子2 mRNA降解，并在多種腫瘤發生和發展過程中起到重要作用[21]。但METTL3是否可介導m6A修飾影響兒童肝母細胞瘤的發生發展仍鮮有報道。本組研究結果顯示，采用METTL3 sgRNA干預后會顯著降低細胞METTL3表達水平，sgRNA組細胞48 h和72 h時細胞增殖水平明顯低于空載體組。進一步分析細胞遷移和侵襲顯示，sgRNA組細胞24 h和48 h時細胞遷移和侵襲水平明顯低于空載體組。通過分析METTL3與IGF2BP3關系分析顯示，sgRNA組細胞中IGF2BP3蛋白及mRNA表達水平明顯低于空載體組。對m6A甲基化水平進行檢測顯示，sgRNA組細胞中m6A-IP及IGF2BP3 m6A相對表達量明顯低于空載體組。在METTL3敲低后會有效介導IGF2BP3 m6A修飾途徑，METTL3缺失后持續調節mRNA甲基化。分析認為，通過有效調節METTL3可有效調節細胞增殖、遷移，進一步分析其作用機制認為，METTL3會有效調節IGF2BP3 m6A修飾而發揮其生理學活性和作用。通過降低METTL3水平會有效抑制和調控細胞周期信號通路，激活細胞凋亡相關信號通路，且其可促進肝細胞凋亡，具有十分重要的作用。

綜上所述，METTL3可有效調節IGF2BP3 m6A修飾并對兒童肝母細胞瘤細胞增殖、遷移進行調控。但METTL3是否可作為臨床治療兒童肝母瘤細胞的潛在靶點，還有待深入研究和分析。