平衡易位攜帶者可利用囊胚形成率的影響因素

吳珊珊 張亞新 劉馨蜜 劉景

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心（鄭州 450000）

染色體平衡易位指兩條染色體各發(fā)生一處斷裂并相互交換其無著絲粒片段，形成兩條新的衍生染色體，是人類最常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，包括相互易位和羅氏易位。因無遺傳物質(zhì)的丟失或重復(fù)，其表型通常是正常的，但攜帶者可產(chǎn)生染色體異常配子，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)或胎兒畸形等不良妊娠結(jié)局[1-2]，染色體異常是早期胚胎停育的主要原因[3]。

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是指對胚胎遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測，篩選出染色體正常或者平衡胚胎進(jìn)行移植，染色體平衡易位攜帶者的不良妊娠結(jié)局可以通過PGT技術(shù)解決[4-5]。目前，臨床上主流做法是將胚胎培養(yǎng)至囊胚期再進(jìn)行活檢，且可根據(jù)獲得活檢的囊胚數(shù)目預(yù)測PGT結(jié)局[6]，但PGT周期中可觀察到不同類型的平衡易位攜帶者獲得的可用于活檢的囊胚數(shù)量差異巨大。有研究表明，與染色體核型正常不孕患者相比，染色體平衡易位攜帶者的囊胚形成率低，且發(fā)育較遲緩[7]。AMIR等[8]結(jié)合PGT和延時(shí)攝影技術(shù)發(fā)現(xiàn)，染色體易位的不平衡胚胎發(fā)育明顯延遲，胚胎分裂不同步。以上臨床現(xiàn)象及文獻(xiàn)均提示不同患者所產(chǎn)生的非平衡配子可能對胚胎發(fā)育及囊胚形成、評分有不同的負(fù)面影響，目前已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)支持[9-10]。而非平衡配子的產(chǎn)生可能與染色體的斷裂位點(diǎn)、易位染色體大小以及攜帶者性別等因素相關(guān)[11-12]。所涉及到的這些因素對囊胚形成和發(fā)育產(chǎn)生影響的相關(guān)研究目前鮮有報(bào)道。

本文擬通過回顧性分析本中心染色體平衡易位攜帶患者PGT周期的臨床資料，旨在探討影響其可利用囊胚形成率的相關(guān)因素。國內(nèi)首次根據(jù)染色體長度和斷裂位點(diǎn)進(jìn)行分組，從新的角度解讀不同特征平衡易位患者的囊胚形成差異，為染色體平衡易位患者提供更精準(zhǔn)的遺傳咨詢，更全面解釋PGT結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月1日至2021年12月31日在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT治療421個(gè)染色體平衡易位周期[其中羅氏易位121（28.7%）周期，相互易位300（71.3%）周期]的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦雙方一方染色體發(fā)生平衡易位。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫婦雙方均有染色體異常；復(fù)雜性染色體結(jié)構(gòu)重排。本研究符合《赫爾辛基宣言》基本原則，經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)日期：2022-08-19，批準(zhǔn)編號：2022-250-01）。

1.2 研究方法根據(jù)國際人類細(xì)胞遺傳命名系統(tǒng)（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN 2020版）[13]，將人類46條染色體按長度遞減順序和著絲粒位置分為7組，以字母A-G表示。本研究將易位的2條染色體中至少1條屬于A組的易位定義為A組，不包含A組染色體的易位定義為非A組。由于羅氏易位比較特殊，均為近端著絲粒染色體（D、G組），根據(jù)兩條染色體來源不同分為DD組，DG組和GG組。

染色體斷裂位點(diǎn)分組具體如下：pq（一個(gè)斷裂位點(diǎn)在染色體長臂，另一個(gè)斷裂位點(diǎn)在染色體短臂），pp（兩個(gè)斷裂位點(diǎn)均位于染色體的短臂），qq（兩個(gè)斷裂位點(diǎn)均位于染色體的長臂）。

1.2.1 促排方案及受精方式根據(jù)不同患者選擇相應(yīng)的卵巢刺激方案，包括拮抗劑方案、GnRH激動劑方案（包括超長方案，早卵泡期長效長方案，黃體中期長效長方案）和高孕激素下促排卵方案（progestin-primed ovarian stimulation，PPOS）。

（1）拮抗劑方案：月經(jīng)周期第3、4天，根據(jù)患者年齡、BMI、激素水平等基本情況給予促性腺激素（gonadotrophin，Gn）100～300 IU/d啟動促排卵，根據(jù)血清激素水平和卵泡發(fā)育情況調(diào)整劑量。卵泡直徑達(dá)到11～12 mm，血清E2＞500 ng/L時(shí)添加促性腺激素釋放激素拮抗劑0.25 mg/d（gonadotropin-releasing hormone antagonists，GnRH-A，思則凱，美國默克雪蘭諾公司或醋酸加尼瑞克注射液，荷蘭）至扳機(jī)日。

（2）早卵泡期長效長方案：月經(jīng)第2～3天肌肉注射長效促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone GnRH-a，達(dá)菲林，中國博福-益普生制藥有限公司）3.75 mg，30～40 d復(fù)診，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予Gn啟動促排卵。

（3）黃體中期長效長方案：月經(jīng)周期第21～23天肌肉注射達(dá)菲林1.5 mg/d，16 d后復(fù)診，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給予Gn促排卵。

（4）超長方案：月經(jīng)周期第2～4天肌肉注射長效GnRH-a（曲普瑞林/亮丙瑞林），28～30 d后復(fù)診，再次注射長效GnRH-a 3.75 mg。28～30 d后復(fù)診，達(dá)到降低調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給予Gn促排卵。

（5）PPOS方案：月經(jīng)周期第2天給予口服孕酮（醋酸甲羥孕酮4～10 mg/d或地屈孕酮片10 mg bid），聯(lián)合Gn促排卵至取卵日。

以上方案均根據(jù)卵泡生長情況和生殖激素水平等進(jìn)行藥物劑量維持和調(diào)整，當(dāng)至少有2個(gè)卵泡直徑達(dá)18 mm或主導(dǎo)卵泡直徑≥16 mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）或GnRHa扳機(jī)，35～38 h后行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。顯微鏡下計(jì)數(shù)卵冠丘復(fù)合物（oocyte-corona-cumuluscomplex，OCCC），培養(yǎng)后對成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）授精。受精后第 1天觀察受精情況，同時(shí)觀察到2個(gè)原核和2個(gè)極體判定為正常受精。

1.2.2 胚胎培養(yǎng)及囊胚評分胚胎均采用序貫培養(yǎng)，原核期采用培養(yǎng)液G-1TM Plus（Vitrolife，瑞典）置于37℃、體積分?jǐn)?shù)6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至卵裂期，培養(yǎng)液G-2TM Plus（Vitrolife，瑞典）中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期。根據(jù)Gardner的評分系統(tǒng)[14]，基于胚泡擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞連接緊密程度分類，對培養(yǎng)至第5～6天（D5-D6）的囊胚進(jìn)行評級。將D5、D6評分≥3期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞不同時(shí)含C級的囊胚定義為可利用囊胚，用于活檢。

可利用囊胚形成率=可利用囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料采用M（P25，P75）表示，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示。采用多變量線性回歸方法分析影響可利用囊胚形成率的獨(dú)立影響因素。根據(jù)既往文獻(xiàn)選擇有相關(guān)關(guān)系的自變量納入回歸方程，并計(jì)算95%置信區(qū)間（95%CI）。納入回歸方程前對所納入的自變量進(jìn)行共線性分析，各變量方差膨脹因子（VIF）均＜10認(rèn)為不存在共線性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群基本情況本研究共納入421 PGT周期，其中男性羅氏易位62（14.7%）個(gè)周期，女性羅氏易位59（14.0%）個(gè)周期，男性相互易位156（37.1%）個(gè)周期，女性相互易位144（34.2%）個(gè)周期，其中38（9%）個(gè)周期無可利用囊胚形成（表1）。

表1 患者基本資料描述Tab.1 Basic data description of patients 例（%）

2.2 相互易位患者可利用囊胚形成率的影響因素分析采用多重線性回歸分析校正混雜因素，納入控制變量包括男女雙方年齡、女方BMI、不孕年限、既往妊娠次數(shù)、活產(chǎn)史、不孕類型、促排方案、基礎(chǔ)FSH和LH、AMH、獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、Gn初始用量和Gn總劑量。納入因變量包括攜帶者性別、染色體斷裂位點(diǎn)（pq/pp/qq）及易位染色體組（A組/非A組）。結(jié)果顯示：相互易位患者中，A組可利用囊胚形成率顯著低于非A組（B=-0.089，P=0.001）；攜帶者性別對可利用囊胚形成率無顯著影響（P=0.713，表2）。

表2 相互易位可利用囊胚形成率的多重線性回歸分析Tab.2 Multiple linear regression analysis of available blastocyst formation rate for the patients with reciprocal translocation

2.3 羅氏易位患者可利用囊胚形成率的影響因素分析納入的控制變量同相互易位，納入因變量包括攜帶者性別，易位染色體組（DD組/DG組）。回歸分析結(jié)果顯示，攜帶者性別（P=0.51）和易位的染色體類型（P=0.261）均不是可利用囊胚形成率的獨(dú)立影響因素（表3）。

表3 羅氏易位可利用囊胚形成率的多重線性回歸分析Tab.3 Multiple linear regression analysis of available blastocyst formation rate for the patients with Robertsonian translocation

2.4 不同類型平衡易位患者可利用囊胚形成率的影響因素分析為了解羅氏易位和相互易位的易位類型對囊胚形成率的影響，本研究對平衡易位所有患者進(jìn)行多重線性回歸分析，納入控制變量同相互易位，納入因變量包括攜帶者性別，易位類型（羅氏易位/相互易位），染色體斷裂位點(diǎn)，染色體分組（A組/非A組），回歸分析結(jié)果顯示，攜帶者性別（P=0.982）和易位類型（P=0.715）均不是可利用囊胚形成率的獨(dú)立影響因素（表4）。

表4 平衡易位可利用囊胚形成率的多重線性回歸分析Tab.4 Multiple linear regression analysis of available blastocyst formation rate for the patients with balanced translocation

3 討論

3.1 相互易位患者易位染色體大小對可利用囊胚形成率的影響在細(xì)胞分裂染色體重排過程中，會出現(xiàn)染色體斷裂、結(jié)構(gòu)重排的現(xiàn)象，導(dǎo)致子代細(xì)胞染色體缺失或重復(fù)（即節(jié)段性非整倍體），染色體異常是早期胚胎停止發(fā)育的重要原因。有研究表明，節(jié)段性染色體非整倍體的存在和類型可能與染色體長度有關(guān)，且來自A組染色體的異常片段長度最大，即染色體缺失或重復(fù)的片段最長[15]。ALFARAWATI等[9]發(fā)現(xiàn)人類較長染色體的不平衡胚胎發(fā)育緩慢且評分較低，認(rèn)為易位的染色體越長，囊胚形成越困難，但該研究只將1～5號染色體與21、22號染色體不平衡胚胎的囊胚形成率進(jìn)行了比較，與本研究的染色體分組方法不同。HUANG等[16]對37對羅氏易位夫婦的272個(gè)胚胎進(jìn)行活檢，根據(jù)熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）結(jié)果將胚胎分為正常/平衡胚胎組和異常胚胎組，發(fā)現(xiàn)正常/平衡胚胎D3優(yōu)質(zhì)胚胎率與非平衡胚胎相比并無顯著差異，而前者第5天/第6天囊胚形成率顯著高于非平衡胚胎組，認(rèn)為產(chǎn)生這種差異的原因是植入前胚胎發(fā)育存在的“自我選擇機(jī)制”主要發(fā)生在囊胚階段，但具體機(jī)制尚不清楚。MéNéZO等[17]也提出相似的結(jié)論，認(rèn)為染色體平衡易位攜帶者的胚胎可通過是否能在體外發(fā)育到囊胚階段進(jìn)行選擇。本研究也觀察到，人類A組染色體相互易位攜帶者的可利用囊胚形成率明顯低于非A組染色體相互易位攜帶者，而羅氏易位攜帶者DD組與DG組的可利用囊胚形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（由于GG組僅4個(gè)周期，因此未將GG組納入回歸分析），表明易位的A組染色體胚胎發(fā)育潛能較差，其可能機(jī)制是染色體減數(shù)分裂過程受染色體類型的影響[12]。

此外，本研究也對人類中等長度染色體易位和短染色體易位間的可利用囊胚形成率進(jìn)行了比較，并未發(fā)現(xiàn)兩者有明顯差異，可能與樣本量較少有關(guān)。以后隨著樣本量的進(jìn)一步加大，筆者會再次關(guān)注此點(diǎn)。

3.2 染色體斷裂位點(diǎn)對可利用囊胚形成率的影響有研究[18]根據(jù)染色體平衡易位斷裂位點(diǎn)分為pp組、qq組、pq組（與本研究染色體斷點(diǎn)分組方法相同），發(fā)現(xiàn)三組間的非平衡胚胎率并無顯著差異，即染色體臂不同的斷裂點(diǎn)并不影響胚胎不平衡染色體的比率。但也有研究認(rèn)為染色體長臂斷點(diǎn)（分組方法與本研究相同）的相互易位存在更高的染色體間效應(yīng)（interchromosomal effect，ICE），可認(rèn)為斷裂位點(diǎn)不同導(dǎo)致了減數(shù)分裂期間染色體分離模式的錯(cuò)亂，致遺傳物質(zhì)異常胚胎增加[19]。該研究納入人群限制女方年齡在38歲以下，且研究樣本量較大（376周期vs.150周期），可能是這兩項(xiàng)研究結(jié)論不同的原因。本研究結(jié)果顯示，染色體斷裂位點(diǎn)位于長臂還是短臂并不影響可利用囊胚的形成。

3.3 攜帶者性別對可利用囊胚形成的影響有學(xué)者認(rèn)為，不同性別染色體易位攜帶者的胚胎染色體減數(shù)分裂分離模式存在明顯差異，女方攜帶者胚胎發(fā)生ICE的風(fēng)險(xiǎn)更高且產(chǎn)生正常配子的比例更低，異常配子的產(chǎn)生阻礙了胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致女方攜帶者的囊胚形成率顯著低于男方，即攜帶者性別對囊胚形成存在明顯影響[20-23]。但目前尚無證據(jù)表明這種減數(shù)分裂分離模式的差異影響平衡胚胎的產(chǎn)生[24]，且上述研究僅對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本間參數(shù)檢驗(yàn)，忽略了混雜因素對統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響，這也可能導(dǎo)致不同的結(jié)論。而最新研究發(fā)現(xiàn)，平衡易位攜帶者性別并不影響減數(shù)分裂期間非易位染色體的穩(wěn)定性，即攜帶者性別對ICE并無顯著影響[25-26]。本研究排除了各項(xiàng)混雜因素影響后發(fā)現(xiàn)，無論相互易位還是羅氏易位，可利用囊胚形成均與攜帶者性別無關(guān)，即攜帶者性別不是影響胚胎發(fā)育的影響因素，這與TONG、WANG 等[11，27]的結(jié)果一致。

3.4 染色體易位類型對可利用囊胚形成的影響李欣媛等[28]通過對122個(gè)染色體平衡易位周期的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，相互易位與羅氏易位攜帶者的胚胎發(fā)育并無顯著差異。雖然有研究者認(rèn)為相互易位的囊胚形成率低于羅氏易位[29]，但未排除混雜因素對結(jié)局的影響。而本研究在排除了各項(xiàng)混雜因素后發(fā)現(xiàn)，易位類型對可利用囊胚形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究為回顧性研究，樣本量不大。僅納入了女性相關(guān)影響因素，并未納入精子質(zhì)量等男性相關(guān)參數(shù)，因此，其結(jié)論尚需未來大樣本、納入全面影響因素后進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，若夫婦雙方中一方為相互易位攜帶者，長染色體發(fā)生易位的可利用囊胚形成率較低；染色體平衡易位攜帶者性別、易位類型和斷裂位點(diǎn)對可利用囊胚形成率均無顯著影響。