甜菜種質資源苗期耐旱性綜合評價

李王勝 王雪倩 尹希龍 石楊 劉大麗 譚文勃 興旺

（1黑龍江大學國家甜菜種質中期庫，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學現代農業與生態環境學院，150080，黑龍江哈爾濱）

甜菜是世界上重要的糖料作物，也可作為飼料原料[1]，隨著對甜菜的不斷研究，目前發現甜菜具有保健功能，如在降脂、降壓等方面[2-3]，應用前景十分廣泛。種質資源又稱遺傳資源，中國保存的種質資源總量突破52萬份，位居世界第二[4]，我國國家甜菜種質中期庫現保存甜菜種質資源1382份[5]，種質資源作為農業“芯片”在科學研究中越來越受重視。我國甜菜主要種植在新疆、內蒙古和黑龍江等地[6]，這些地區的年降水量多在400mm以下[7]，并且近年來全球變暖造成水資源短缺，干旱成為影響我國甜菜生產的主要非生物因素[8]。苗期耐旱能力直接影響甜菜的生長以及產量，因此對甜菜種質資源進行苗期耐旱試驗，篩選出優異的耐旱種質資源，對促進我國農業發展、加強生態環境安全和可持續發展具有重要意義。

甜菜苗期對水分脅迫的反應可從形態指標和生理生化指標進行鑒定，前人[9]研究發現，結合各指標進行耐旱性綜合評價能更科學合理地篩選耐旱種質。目前綜合評價的分析方法已經在大豆[10]、甘蔗[11]、薏苡[12]和菜豆[13]等作物上應用并取得了理想的效果，甜菜的耐旱研究也有報道[14-15]，但是應用綜合評價的方法對大量甜菜種質資源的耐旱性進行分析的研究鮮有報道。

本研究以336份國家甜菜種質中期庫中保存的甜菜種質資源為材料，通過PEG-6000模擬干旱脅迫對甜菜苗期的株高、根長、可溶性糖和游離脯氨酸含量等15個指標進行分析。通過隸屬函數法、主成分分析法、相關分析法和聚類分析法綜合評價甜菜種質資源的耐旱性，試驗主要目的是進一步完善甜菜種質資源耐旱評價體系和評價指標，篩選出苗期耐旱種質資源，為今后甜菜種質資源耐旱研究以及育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以國家甜菜種質中期庫提供的來源于17個國家的336份甜菜種質資源為材料，其中中國205份、英國2份、意大利5份、匈牙利2份、瑞典5份、日本9份、俄羅斯16份、美國49份、羅馬尼亞2份、荷蘭12份、法國3份、德國10份、丹麥1份、朝鮮1份、波蘭11份、比利時2份以及奧地利1份。

1.2 試驗設計

試驗于2021年3-12月在黑龍江大學國家甜菜種質中期庫（126°45′E，45°30′N）智能人工氣候室內進行，以PEG-6000模擬干旱脅迫，通過實驗室前期試驗設置9%濃度時脅迫效果顯著且未致死，所以確定設置干旱9%PEG-6000的Hoagland溶液（DS）和對照Hoagland溶液（CK）2個處理組，重復3次。

每份種質挑選30顆籽粒飽滿、大小均勻的種子，用75%酒精浸泡1min后用自來水沖洗1min，在2‰的福美雙溶液浸泡12h，將種子表面殘留藥物用自來水沖洗干凈并播于蛭石中，每天定時噴水，待子葉長出，每份挑選長勢一致的幼苗12株，洗去根上的蛭石后用海綿定植于24孔水培盆（長37.5cm，寬25.5cm，高13.5cm）中，盆中加入Hoagland營養液9L，每7d更換1次營養液，定植14d后（3對真葉時）進行干旱和對照處理，通過實驗室前期試驗設置脅迫2、5和7d，7d時效果最好，所以確定脅迫7d后測定最大根長、株高、根鮮重、葉鮮重、葉片飽和鮮重、葉干重、根干重、胚軸直徑、葉片相對含水量、根冠比、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性以及可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛含量。

1.3 測定項目與方法

最大根長（root length，RL）和株高（plant height，PH）用直尺測量，根鮮重（root fresh weight，RFW）、葉鮮重（leaf fresh weight，LFW）、葉片飽和鮮重（leaf saturated fresh weight，LSFW）、葉干重（leaf dry weight，LDW）和根干重（root dry weight，RDW）用電子天平稱重，胚軸直徑（embryonic axis diameter，EAD）使用游標卡尺測量。

葉片相對含水量（relative leaf water，RLW）：RLW[16]=(LWF–LDW)/(LSFW–LDW)

根冠比（root-shoot ratio，RSR）：RSR=RFW/LFW

使用氮藍四唑法[17-19]（NBT methods）測定SOD活性，使用蒽酮比色法[20]（anthrone colorimetry）測定可溶性糖（soluble sugar，SS）含量，使用硫代巴比妥酸法[20]（TBA法）測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，使用酸性茚三酮法[20]（acid ninhydrin process）測定脯氨酸（proline，Pro）含量，使用BCA試劑盒測定可溶性蛋白質（soluble protein，SP）含量。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2007和SPSS 26.0對數據進行處理分析，使用Origin 2021畫圖。參考趙振寧等[21]和謝小玉等[22]的方法，根據所測量的指標計算耐旱系數（drought resistance coefficient，DC）、隸屬函數值[μ(Xi)]和耐旱性度量值（drought tolerance measurement，D）。使用Origin 2021系統聚類中的Ward法對甜菜種質資源D值進行聚類分析，并對D值和各指標耐旱系數進行相關性分析。

分析中涉及的計算公式如下：

式中，Xi為第i個指標干旱處理后與對照處理的相對值，Ximin和Ximax分別表示第i個指標耐旱系數的最小值和最大值。

式中，F(Xj)表示第j個綜合指標值，aij表示各指標所對應的特征值，Xij為各指標標準化處理的值。

式中，Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中所占的權重，Pj表示各種質第j個綜合指標的方差貢獻率。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對各指標的影響

由圖1可知，PEG-6000模擬干旱脅迫條件下，336份甜菜種質資源的胚軸直徑、葉干重、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉片飽和鮮重和葉片相對含水量等表型性狀均極顯著低于對照，干旱脅迫后根冠比、SS、SP和Pro含量等4個指標均極顯著高于對照；SOD活性和MDA含量在干旱和對照處理下差異并不顯著。不同甜菜種質的各指標在干旱脅迫后變化趨勢不同，很難根據單一指標的變化情況客觀、準確地比較不同甜菜種質耐旱情況，應該運用多指標綜合評價的方法。

圖1 干旱脅迫對336份甜菜種質資源各指標的影響Fig.1 Effects of drought stress on indexes of 336 sugar beet germplasm resources

2.2 主成分分析

由表1可知，前6個主成分因子可代表全部信息的75.95%，其中λ＞0.918。根據結果可將原有的15個指標轉化為6個相互獨立的綜合指標。第1主成分的貢獻率為36.47%，其中胚軸直徑、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重和葉片飽和鮮重等指標的載荷系數絕對值較大，說明第1主成分主要反映的是生物量信息；第2主成分的貢獻率為11.05%，其中SS和SP的載荷系數絕對值較大，說明第2主成分主要反映的是滲透調節物質的信息；第3主成分的貢獻率為9.36%，其中根長、葉片相對含水量和根冠比的載荷系數較大，說明第3主成分主要反映的是干旱脅迫下會增長的表型指標；第4主成分的貢獻率為6.68%，其在SOD上有較高載荷系數；第5主成分的貢獻率為6.26%，其在MDA含量上有較高載荷系數；第6主成分的貢獻率為6.12%，其在Pro含量上有較高載荷系數。

表1 甜菜種質資源各指標的主成分分析Table 1 Principal component analysis of various indexes of sugar beet germplasm resources

由主成分分析（圖2）可將336份種質大致分成3個類群，類群1是耐旱表現較好的種質，包括10、79、84、85、124、182、230、251、293 和 298號等10份；類群3是耐旱表現較差的種質，包括42、133、144、229和267號等5份；類群2的種質耐旱性介于類群1和類群3之間。

圖2 336份甜菜種質資源各指標主成分分析Fig.2 Principal component analysis of indexes of 336 sugar beet germplasm resources

2.3 耐旱性綜合評價

通過公式(1)計算耐旱系數，利用公式(2)和(3)計算各種質的綜合指標值，再結合公式(4)計算各綜合指標的權重，最后根據公式(5)得到各甜菜種質資源的耐旱性度量值（D）（圖3），336份甜菜種質資源D值介于0.135～1.289，平均值為0.392，D值越大表示該甜菜種質耐旱性越強。耐旱性突出的種質有10、85和182號等，耐旱性弱的種質有42、133和310號。D值計算耐旱性的結果與主成分分析結果基本吻合。

圖3 336份甜菜種質資源D值散點圖Fig.3 Scatter plot of D values of 336 sugar beet germplasm resources

2.4 甜菜種質資源耐旱性聚類分析

對336份甜菜種質資源D值進行聚類分析（圖4），共分為5類。第Ⅰ類為耐旱性強種質，有16份，占總數的4.76%，D值平均值為0.806；第Ⅱ類為耐旱性較強的種質，有49份，占總數的14.58%，D值平均值為0.564；第Ⅲ類為耐旱性中等的種質，有109份，占總數的32.44%，D值變化范圍為0.363～0.501；第Ⅳ類為耐旱性較弱的種質，有79份，占總數的23.51%，D值平均值為0.326；第Ⅴ類為耐旱性弱的種質，有83份，占總數的24.70%，D值變化范圍為0.135～0.283。

圖4 336份甜菜種質資源耐旱性分析聚類圖Fig.4 Cluster diagram of drought tolerance analysis of 336 sugar beet germplasm resources

2.5 D值與各指標的相關性分析

根據相關性分析結果（圖5）可知，表型指標除葉片相對含水量和根冠比外其余各指標間均表現出顯著正相關；根冠比與株高、葉鮮重、葉干重和葉片相對含水量呈顯著負相關。表型指標與生理指標間除葉片相對含水量與SS間呈極顯著相關外其余各指標間均無顯著相關性。生理生化指標中滲透調節物質含量間呈極顯著正相關，MDA含量與SP含量呈顯著正相關，SOD活性與SP和Pro含量均呈顯著正相關。D值與10個表型指標均表現出顯著相關性，其中，D值與胚軸直徑、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重、葉片飽和鮮重和葉片相對含水量呈顯著正相關，D值與根冠比呈顯著負相關，D值與5個生理生化指標均無顯著相關性。

圖5 耐旱性度量D值與各耐旱系數指標的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between D value of drought tolerance measure and drought tolerance coefficient of each index

3 討論

3.1 耐旱性評價方法的選擇

在對植物的耐旱性進行評價時，如果只采取等權重的綜合評價方法往往會忽略了各指標不同的重要程度，目前大多數學者都會采用多種方法相結合進行評價，本研究參考趙振寧等[21]和謝小玉等[22]對耐旱研究的綜合評價方法，采用隸屬函數值法和抗旱性度量值法結合抗旱系數對336份甜菜種質資源進行主成分分析[23]、聚類分析[17]、綜合評價分析和相關性分析[24]，從而客觀、具體、準確地對336份甜菜種質資源的耐旱性進行評價，使鑒定結果更接近真實情況。

本研究通過以上方法得出各甜菜種質資源的D值與主成分分析結果高度符合，也從側面印證了綜合評價方法的可靠性。最終將甜菜種質資源的耐旱性分別為5個類群，篩選出耐旱型甜菜種質16份，這一結果與汪燦等[12]在薏苡中的研究結果一致。本研究鑒定出的耐旱材料可作為優良的甜菜種質資源加入到國家甜菜種質中期庫的核心種質中，以便在今后新品種培育中加以利用。

3.2 干旱對甜菜種質資源表型和生理生化指標的影響

干旱脅迫可對植物的基因表達、代謝和生長變化產生影響，這些影響往往在幾秒鐘、幾小時和幾天內顯現出來，但是這些變化中最先被觀察到的是生長變化的影響[25]，所以在干旱研究中表型指標至關重要。本研究的10個表型指標中有9個在經過干旱脅迫后是顯著下降的，只有根冠比在干旱脅迫后顯著增加，這表明干旱脅迫對表型指標的影響是顯著的，可利用以上表型指標對甜菜種質資源進行耐旱性評價。

植物應對干旱的主要生理生化表現有抗氧化酶系統、滲透調節、活性氧代謝和產生抗逆蛋白等[26]。游離脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質和自由基清除劑[27]，SOD可降低活性氧對植物的損傷[28]，MDA能夠反映植物體內活性氧物質對質膜透性的損失程度[26]，滲透調節物質可以降低植物體內滲透勢，從而降低水勢，提高從外界吸收水分的能力[29]。本研究中，干旱脅迫后SS、SP和Pro含量顯著上升，SOD活性和MDA含量變化不顯著，可能是干旱脅迫后這2個指標升高和降低的種子數量相當，這2個指標對干旱脅迫的敏感性在不同甜菜種質中表現不同。

3.3 甜菜耐旱性評價指標的選擇

植物的耐旱性是一個復雜的過程，不同的指標對干旱脅迫反應的敏感性和速度不同，植物在應對干旱脅迫時會隨著脅迫的時間呈現出階段性的特點，根系在感受到脅迫信號后，通過信號傳導調節體內酶活性和滲透調節物質的表達，進而影響表型指標，使植物來適應外界脅迫[30-32]，本研究通過對336份甜菜種質資源脅迫7d后的各指標的耐旱系數和D值進行相關性分析，發現D值與所測的5個生理生化指標（SS、SP、SOD、Pro和MDA）均無顯著相關性，與10個表型指標（EAD、PH、RL、LFW、RFW、RDW、LDW、LSFW、RLW和RSR）均表現出顯著相關性，在長時間的干旱脅迫下甜菜種質耐旱鑒定可依據表型指標進行，這一結果與路之娟等[33]在苦蕎中的研究結果相似。D值與根鮮重、胚軸直徑和葉鮮重的相關系數分別為0.91、0.89和0.89，在大田試驗中可以依據地上部指標葉鮮重、地下部指標根鮮重和胚軸直徑這3個指標對甜菜種質耐旱性快速、有效地進行鑒定。

4 結論

本研究通過對336份甜菜種質資源苗期耐旱性進行分析，對D值進行聚類分析，篩選出16份苗期耐旱性強的甜菜種質。并根據相關性分析確定了D值與胚軸直徑、株高、根長、葉鮮重、根鮮重、根干重、葉干重、葉片飽和鮮重和葉片相對含水量呈顯著正相關，D值與根冠比呈顯著負相關，本研究結果可以為甜菜抗旱育種提供材料和理論基礎。