植煙生態(tài)區(qū)、品種及其互作對烤煙多酚含量及品質(zhì)的影響

陳燕 陳強 何軼 喻會平 郜軍藝 趙二衛(wèi) 陸引罡

（1貴州大學農(nóng)學院，550025，貴州花溪；2貴州大學煙草學院，550025，貴州花溪；3貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，551700，貴州畢節(jié)）

多酚（polyphenols）是一類獨特的植物化學物質(zhì)，是煙草重要的次生代謝產(chǎn)物和香氣前體物質(zhì)[1]。煙草中多酚類物質(zhì)主要有咖啡單寧類（綠原酸）、香豆素類（莨菪亭、莨菪靈）和黃酮醇類（蕓香苷、山奈酚糖苷）等，其中綠原酸和蕓香苷是煙葉中主要的多酚類物質(zhì)，占90%左右[2]。這些致香前體物質(zhì)的合成和積累受光照[3]、溫度[4]、品種[5]、施氮量[6]和栽培措施[7]等條件的影響。品種是決定煙葉風格和質(zhì)量的內(nèi)在因素，品種內(nèi)含基因的表達方式和水平受環(huán)境影響，在煙草的生長過程中，生態(tài)條件和栽培措施通過影響煙葉化學成分和主要次生代謝產(chǎn)物的含量及比例，對煙葉品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[8]。

煙草品種是煙葉生產(chǎn)的物質(zhì)基礎，是提高煙葉質(zhì)量的內(nèi)因[9]。然而我國煙葉生產(chǎn)中依舊面臨著品種種植單一的問題[10]。畢節(jié)煙區(qū)煙葉因具有獨特的清香型[11]深受卷煙工業(yè)企業(yè)的青睞，近年來，畢節(jié)市煙葉產(chǎn)量實現(xiàn)了突破，但煙葉質(zhì)量還有待同步提升，優(yōu)質(zhì)適產(chǎn)的矛盾依然存在。因此亟需引進適合畢節(jié)生態(tài)環(huán)境的新品種。云煙105和云煙116均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院選育，通過云南省烤煙品種審定委員會審定并在多個煙區(qū)推廣種植[10-12]。本文以云煙105和云煙116為試驗材料，研究2個品種在畢節(jié)地區(qū)2個典型生態(tài)煙區(qū)的煙葉多酚類物質(zhì)含量及化學品質(zhì)指標的差異，為畢節(jié)市煙葉新品種的應用及推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云煙105和云煙116由畢節(jié)煙草公司提供。烤煙專用基肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)=9:10:27]和專用追肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)=13:0:26]的施用量分別為652和288.5kg/hm2。

貴州省畢節(jié)市大方縣六龍科技園（105°42′22″E，27°9′5″N）海拔1448m，屬北亞熱帶濕潤季風氣候，全年平均霧日為159.2d，占全年天數(shù)的43.6%，日照時數(shù)1311.2h，無霜期254～325d。土壤全氮1.31g/kg、堿解氮92.42mg/kg、有效磷22.14mg/kg、速效鉀121.37mg/kg、有機質(zhì)22.71g/kg、pH 6.53。貴州省畢節(jié)市威寧彝族回族苗族自治縣黑石科技園（26°45′56″E，105°58′45″N）海拔 2220m，為高原氣候，年均日照時數(shù)1800.0h，無霜期180d。土壤全氮1.07g/kg、堿解氮62.37mg/kg、有效磷11.85mg/kg、速效鉀 77.71mg/kg、有機質(zhì) 16.81g/kg、pH 6.12。貴州畢節(jié)大方和威寧的降雨、氣溫情況見表1。

表1 貴州省畢節(jié)市大方和威寧的降雨、氣溫Table 1 The rainfall,temperature of Dafang and Weining of Bijie city,Guizhou province

1.2 試驗設計

采用二因素隨機區(qū)組試驗，設置4個處理，分別為大方生態(tài)區(qū)，云煙105（DF-105）；大方生態(tài)區(qū)，云煙116（DF-116）；威寧生態(tài)區(qū)，云煙105（WN-105）；威寧生態(tài)區(qū)，云煙116（WN-116）。3次重復，每小區(qū)面積為67m2，行株距為110cm×55cm，種植密度為16 500株/hm2，純N施用量為93.75kg/hm2，基追比為6:4，基肥于移栽前一天起壟時施入，追肥于移栽15d后隨水施入煙株根部。同一區(qū)組內(nèi)隨機排列，小區(qū)及區(qū)組間設置保護行和走道，試驗期間，各處理小區(qū)煙苗移栽、灌溉、中耕除草及病蟲害防治措施管理均按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理方式進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 多酚 各處理選取外觀質(zhì)量均勻一致的初烤煙葉（C3F），去梗切絲后在40℃下干燥12h，研磨過40目篩，密封置于冰箱中（-10℃）。參照煙草行業(yè)標準YC/T 202-2006[13]測定多酚類化合物含量。高效液相色譜（美國Agilent公司，Agilent 1260）分析，流動相 A：V水:V甲醇:V乙酸=88:10:2；流動相 B：V水:V甲醇:V乙酸=10:88:2，流動相 C：100%甲醇。 柱溫30℃，柱流量1mL/min，進樣體積10μL。梯度：0min，100%A；16.5min，80%A+20%B；30min，20%A+80%B；34min，100%C。檢測波長340nm，參比波長480nm，分析時間約為40min。用新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭和蕓香苷標準品制作標準曲線，外標法計算樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭、蕓香苷和總酚（以樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量的總和計為總酚）含量。

1.3.2 常規(guī)化學品質(zhì)指標 各處理選取外觀質(zhì)量均勻一致的初烤煙葉（C3F），在55℃烘至恒重，研磨過40目篩，裝入自封袋備用。用H2SO4-H2O2消化法測定煙葉氮、磷和鉀含量，用3，5-二硝基水楊酸比色法測定煙葉還原性糖和總糖含量，用紫外分光光度法測定煙葉煙堿含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Office Excel 2016、DPS 7.05及 Origin 2018進行統(tǒng)計分析與圖形制作，采用Duncan法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同生態(tài)區(qū)煙葉多酚含量的差異分析

如圖1所示，5種多酚物質(zhì)峰形和分離效果均較好。對2個生態(tài)區(qū)烤后煙葉的多酚類物質(zhì)含量進行方差分析，結果（表2）表明，植煙生態(tài)區(qū)之間烤煙多酚類物質(zhì)含量差異較大，除隱綠原酸和蕓香苷未達顯著差異水平外，新綠原酸、綠原酸、莨菪亭及總酚含量均達到顯著差異水平。其中大方地區(qū)新綠原酸（2.26mg/g）、綠原酸（13.37mg/g）和總酚（24.93mg/g）含量均顯著高于威寧地區(qū)；而莨菪亭含量與之相反。

圖1 多酚標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of polyphenol standard

表2 不同生態(tài)區(qū)間多酚類物質(zhì)含量Table 2 The contents of polyphenols in different ecological intervals mg/g

2.2 不同品種間煙葉多酚含量的差異分析

對2個品種烤后煙葉的多酚類物質(zhì)含量進行方差分析，結果（表3）表明，不同品種間烤煙多酚類物質(zhì)含量差異較大。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蕓香苷及總酚含量均以云煙105更高，分別為2.36、14.49、2.95、7.10和27.21mg/g，顯著高于云煙116，2個煙草品種莨菪亭的含量均為0.30mg/g。

表3 不同品種間多酚類物質(zhì)含量Table 3 The content of polyphenols among different varieties mg/g

2.3 不同處理間煙葉多酚含量的差異分析

對不同處理間烤后煙葉的多酚物質(zhì)含量進行方差分析（圖2），植煙生態(tài)區(qū)與品種各組合間多酚類物質(zhì)含量差異顯著，其中以大方地區(qū)與云煙105組合的新綠原酸（2.58mg/g）、綠原酸（16.35mg/g）、隱綠原酸（3.19mg/g）和總酚（29.64mg/g）的含量均顯著高于其他組合；新綠原酸和隱綠原酸含量均表現(xiàn)為DF-105＞W(wǎng)N-105＞DF-116、WN-116，綠原酸和總酚含量均表現(xiàn)為DF-105＞W(wǎng)N-105＞W(wǎng)N-116＞DF-116，差異顯著。而莨菪亭含量以WN-116處理最大，為0.35mg/g，其次為WN-105處理，DF-116處理最低，僅為0.24mg/g。DF-105處理的蕓香苷的含量最大，為7.26mg/g，DF-116處理的蕓香苷含量最低，僅為5.40mg/g，顯著低于其他組合。

圖2 不同處理間煙葉多酚含量差異分析Fig.2 Difference analysis of polyphenol contents in tobacco leaves among different treatments

2.4 不同生態(tài)區(qū)及品種對煙葉多酚類物質(zhì)含量貢獻率的分析

對不同植煙生態(tài)區(qū)與品種及其互作對烤煙多酚類物質(zhì)含量的方差分析（表4）表明，煙葉多酚類物質(zhì)含量顯著受植煙生態(tài)區(qū)、烤煙品種及生態(tài)區(qū)與品種間交互作用的影響。品種對新綠原酸的含量貢獻率最大，占總變異的68.53%，其次為生態(tài)區(qū)的貢獻率，為22.68%，生態(tài)區(qū)與品種的交互最低，僅為8.79%。品種對綠原酸的含量貢獻率最大，占總變異的60.91%，生態(tài)區(qū)與品種的交互次之，占總變異的31.41%，生態(tài)區(qū)影響最小，僅為7.68%。品種對隱綠原酸含量的貢獻率最大，為82.39%，其次為生態(tài)區(qū)，占總變異的9.67%，生態(tài)區(qū)與品種的交互最低，僅為7.94%。生態(tài)區(qū)對莨菪亭含量的貢獻率最大，占總變異的的94.40%，而品種及品種與生態(tài)區(qū)的交互對莨菪亭的影響未達到顯著差異水平。品種對蕓香苷含量的貢獻率最大，占總變異率的63.10%，生態(tài)區(qū)與品種的交互次之，占總變異的27.42%，生態(tài)區(qū)影響最小，僅為9.48%。品種對總酚的含量貢獻率最大，占總變異率的69.34%，生態(tài)區(qū)與品種的交互次之，占總變異的27.52%，生態(tài)區(qū)影響最小，僅為3.14%。

表4 生態(tài)區(qū)與品種對烤煙多酚類物質(zhì)影響的雙因素方差分析Table 4 Two-factor analysis of variance for the effects of interaction between ecoregions and varieties on polyphenols in flue-cured tobacco

2.5 不同生態(tài)區(qū)及不同品種烤煙多酚類物質(zhì)主成分分析

基于多酚類物質(zhì)含量的煙葉樣品進行主成分分析，前2個主成分（品種和地區(qū)因素）分別為69.7%和25.7%，取第1、2個主成分得分作圖來表征不同處理煙葉多酚含量（圖3）。4個組合烤煙分布在不同的區(qū)域，處理間樣品離散型較大。品種間多酚類物質(zhì)含量主要表現(xiàn)在PC1上，即云煙105與PC1呈正相關，而云煙116與PC1呈負相關。不同植煙生態(tài)區(qū)多酚類物質(zhì)含量主要表現(xiàn)在PC2上，即大方地區(qū)與PC2呈負相關，而威寧地區(qū)則與PC2呈正相關。

圖3 不同生態(tài)區(qū)及不同品種烤煙多酚類物質(zhì)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of polyphenols in different varieties of flue-cured tobacco in different ecological regions

2.6 不同生態(tài)區(qū)及不同品種烤后煙葉常規(guī)化學品質(zhì)分析

由表5可知，各組合烤煙常規(guī)化學品質(zhì)指標處于優(yōu)質(zhì)煙葉范圍，威寧地區(qū)煙葉含氮量顯著高于大方地區(qū)，2個品種間無顯著差異。磷含量以DF-105處理最高，為0.22%，煙葉鉀、還原糖和總糖含量整體表現(xiàn)為云煙105＞云煙116，大方地區(qū)＞威寧地區(qū)，均以DF-105處理最高。云煙116煙堿含量顯著高于云煙105，以DF-116含量最高，為2.51%，DF-105煙堿含量最低，僅為1.81%，顯著低于其他處理。

表5 各處理煙株烤后煙葉常規(guī)化學品質(zhì)Table 5 Conventional chemical quality of flue-cured tobacco leaves in different treatments %

2.7 不同生態(tài)區(qū)及不同品種烤煙煙葉各品質(zhì)指標間的相關性分析

對不同生態(tài)區(qū)和不同品種烤煙葉片多酚類物質(zhì)含量及常規(guī)化學品質(zhì)指標進行相關性分析（圖4）可知，新綠原酸、總酚、鉀、綠原酸、隱綠原酸、總糖、還原糖和蕓香苷的含量呈顯著正相關關系；煙葉磷含量僅與鉀、總糖含量呈顯著正相關，與莨菪亭呈顯著負相關關系；煙葉氮含量則與莨菪亭含量呈顯著正相關關系；煙堿含量與磷、莨菪亭和氮含量相關性未達顯著水平，與其余各指標間均呈顯著負相關關系。

圖4 各處理煙株煙葉各品質(zhì)指標間相關性分析Fig.4 Correlation analysis among various quality indexes of tobacco leaves in different treatments

3 討論

綠原酸是煙草中含量最高的多酚化合物，也是僅有的單寧類物質(zhì)[14]。綠原酸不僅影響煙草的生長發(fā)育，對煙葉香吃味、調(diào)制特性及色澤等也有重要影響[15]，提高煙草中新綠原酸和綠原酸含量可顯著提高煙葉整體的感官質(zhì)量[16]。生態(tài)因子及烤煙品種均是影響煙葉中3種綠原酸異構體含量的重要影響因素。本研究表明，大方植煙生態(tài)區(qū)中部煙葉綠原酸含量顯著高于威寧地區(qū)，威寧處于高海拔地區(qū)，UV-B（中波紫外線輻射，波長為280～320nm）更多，UV-B輻射上升造成多酚氧化酶和過氧化物酶含量升高，使中部煙葉多酚氧化分解[17-18]；品種對3種綠原酸異構體的貢獻率均在60%以上，這與孫志浩等[19]的研究結果一致。可見，品種的遺傳特性是決定煙葉綠原酸含量的主導因素。

莨菪亭是煙草多酚類物質(zhì)的重要組成因素之一，本研究表明，云煙105和云煙116間莨菪亭含量無顯著差異，植煙區(qū)生態(tài)環(huán)境的差異是造成2個品種莨菪亭含量變化的主導因素，因此選擇適宜的生長環(huán)境更有利于調(diào)控莨菪亭含量。

蕓香苷屬于類黃酮，具有由苯甲酰共軛體系和肉桂酰共軛體系組成的交叉共軛體系，其越大，紫外吸收能力越強，對紫外光的吸收范圍較寬[20-21]。Bilger等[22]研究表明，溫度是植物表皮紫外線透過率的決定因素，低溫有利于多酚（特別是蕓香苷）的生物合成，紫外輻射和低溫均會引起植物蕓香苷含量的增加[23]。因此威寧生態(tài)區(qū)的生態(tài)特點更有利于促進蕓香苷的合成和積累。本研究表明，云煙116的蕓香苷含量表現(xiàn)為威寧地區(qū)高于大方地區(qū)，但2個生態(tài)區(qū)間云煙105蕓香苷的含量無顯著差異。而王育軍等[24]在對NC102和NC297的研究中表明，在1700～2200m內(nèi)，隨海拔升高，蕓香苷含量逐漸下降。可見，不同品種對不同植煙生態(tài)區(qū)的適應情況不同。

本研究對煙葉常規(guī)化學指標及多酚類物質(zhì)含量的相關性分析表明，煙葉常規(guī)化學指標與多酚類物質(zhì)關系密不可分，其中煙葉還原糖和水溶性總糖與多酚類物質(zhì)呈顯著正相關關系，這與姜慧娟等[25]的研究結果一致，可能與煙草中多酚通常以糖苷或酯形式存在有關[26]。研究[27]表明，多酚類物質(zhì)在高糖類群煙葉內(nèi)表現(xiàn)較為穩(wěn)定，而在低糖類群煙葉內(nèi)穩(wěn)定性較差。畢淑峰等[28]對云南烤煙評吸質(zhì)量與化學成分的關系研究認為，煙堿與香氣質(zhì)、余味、雜氣和刺激性分值呈顯著或極顯著負相關，與濃度分值呈顯著正相關。李文卿等[29]研究表明，在一定范圍內(nèi)隨煙堿含量的增加，多酚含量呈逐漸降低趨勢，本試驗也得出相似的結論。

4 結論

本研究結果表明，煙葉中多酚類物質(zhì)含量在不同植煙生態(tài)區(qū)和品種間的差距均達到顯著差異水平，其中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量主要受品種影響最大，而莨菪亭則受植煙生態(tài)區(qū)的影響更大，其中云煙105在大方生態(tài)煙區(qū)的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量更高，而云煙116在威寧生態(tài)煙區(qū)的莨菪亭含量更高；煙葉磷、鉀、還原糖及總糖含量與多酚類物質(zhì)含量呈顯著正相關關系，煙堿含量則與多酚類物質(zhì)含量呈顯著負相關關系。綜合煙葉多酚及化學成分來看，畢節(jié)新引品種云煙105和云煙116更適宜種植在大方地區(qū)，且云煙105表現(xiàn)優(yōu)于云煙116。