重組人血小板生成素對凝血酶誘導血小板凋亡的調節作用

周先桃 李瑜 沈陽 王正華

1武漢血液中心（武漢 430030）；2湖北省中西醫結合醫院（武漢 430015）

在炎癥應激、傷口愈合、膿毒癥等疾病的進展中，患者極易出現“血小板減少癥”[1]。研究[2]顯示血小板凋亡是導致“血小板減少癥”中的關鍵事件。研究[3]顯示血小板的核糖體能合成B淋巴細胞瘤?xl（B cell lymphoma?xl，Bcl?xl）、Bcl?2同源拮抗劑/殺傷劑蛋白（Bcl?2 homologous antagonist/killer，Bak）等凋亡相關蛋白。YADAV等[4]研究顯示血小板的線粒體的形態與“血小板減少癥”病癥的進展關系密切。血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是血小板生成重要的調控因子。隨著生化技術的進步，重組人血小板生成素（recombinant human TPO，rhTPO）的應用成為研究熱點之一。有研究[5]顯示皮下注射rhTPO對腦腫瘤患兒化療所致血小板減少癥的預防效果較好，且不良反應發生率低，但是有關rhTPO在血小板凋亡中的作用報道較少。凝血酶（thrombin，TMB）是一種血小板激動劑，ROKA?MOIIA 等[6]研究報道 TMB 能明顯抑制血小板中細胞色素 C（cytochrome c，Cyt?c）的轉錄與表達，升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，誘導其凋亡。本研究旨在探討rhTPO對TMB誘導血小板凋亡的作用機制，以為藥物的推廣應用提供可靠的事實數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料分別收集10例健康成年男性的空腹靜脈血10 mL，血型均為O型，年齡（20.35±6.66）歲。本研究已獲取研究對象的知情同意書，并獲得醫院倫理委員會的審核批準（編號：2021?1207?QV03）。

1.2 試劑與儀器TMB購自美國Invitrogen公司，2′，7′?二氯熒光素二乙酸酯（2，7?dichlorodihydro?fluoresceindiacetate，DCDHF?DA）染色試劑盒購自美國 Sigma?Aldrich 公司，兔抗大鼠分裂蛋白1（mi?tochondrial fission 1 protein，Fis?1）、融合蛋白 2（mi?tofusin2，Mfn 2）、動力相關蛋白 1（dynamin?related protein 1，Drp?1）、視神經萎縮蛋白 1（optic atrophy 1，Opa 1）、Cyt?c、Bcl?xl、Bak 抗體購自英國 Abcam公司。

定量反轉錄?聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction，qRT?PCR）擴增儀、BD FACSCalibur流式細胞儀（美國Bio?Rad公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 血小板的制備參照SHPAKOVA等[7]介紹的方法將獲取的空腹靜脈血與檸檬酸葡萄糖緩沖液以7∶1稀釋比例混合，加入適量抗凝劑，300 μg離心15 min，留取上層，即為富含血小板的血漿，再以1 500×g離心5 min，棄掉上清，以預制緩沖液將細胞沉淀重懸，再次以1 500×g離心5 min，棄掉上清，以改良的臺式緩沖液重懸細胞沉淀，獲得血小板懸液，加入適量的氯化鈣和氯化鎂，室溫下避光靜置1 h后，即洗滌血小板制備成功。

1.4 實驗分組[8]將制備的洗滌血小板懸液分組如下：Normal組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL生理鹽水刺激；TMB組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL的200 U/mL TMB刺激；rhTPO低、中、高劑量組（TMB+10/50/100 ng/mL rhT?PO）組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL的rhTPO（濃度為10/50/100 ng/mL）孵育30 min后添加5 μL的200 U/mLTMB刺激。

1.5 血小板中線粒體的形態洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，按線粒體紅色熒光探針（MitoTracker Red CMXRos）染色試劑盒要求進行染色，室溫下避光孵育30 min，中性甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡觀察各組血小板中線粒體形態的改變，Image J圖像處理軟件統計分析細胞內線粒體的完整性[9]。

1.6 血小板的細胞的凋亡率實驗分組同1.4，無菌操作臺上，加入200 μL的緩沖液，重懸后，加入5 μL膜聯蛋白V?異硫氰酸熒光素（Annexin V?FITC），室溫下避光孵育15 min，加入10 μL/碘化丙啶（PI），BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測[10]。

1.7 血小板中ROS的水平洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，添加適量DCDHF?DA染色液，37℃恒溫水浴鍋中避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察，Image J圖像處理軟件統計分析視野中的綠色熒光強度均值[11]。

1.8 血小板中相關基因的表達洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，按Trizol reagent試劑盒要求提取血小板中的總RNA，其完整性和濃度經Q1AGEN RNeasy Mini Kit確定后，在逆轉錄試劑盒操作說明書的指導下合成cDNA，CFX96熒光定量PCR儀進行擴增。以β?肌動蛋白（β?actin）為參照物，目的基因的相對表達以 2?ΔΔCt進行表示[12]。各基因的序列見表1。

表1 各基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

1.9 血小板中Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達常規提取樣本中的總蛋白，以50 μg進行電泳，轉膜，封閉，加入一抗，孵育，加入二抗，化學發光后，顯影，掃描，統計分析各條帶的灰度值。

1.10 統計學方法采用SPSS 21.0進行統計分析，符合正態分布的數據采用（）進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血小板中線粒體分裂程度與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組中血小板中完整線粒體的比例明顯下降，差異均具有統計學意義（F=76.374，P＜0.05），與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組中血小板中完整線粒體的比例明顯升高，并且具有明顯的劑量依賴性，差異均具有統計學意義（F=53.129，P＜0.05），見圖1。

圖1 血小板中的線粒體分裂程度（MitoTracker Red CMXRos染色，×400）Fig.1 The comparison of the degree of mitochondrial fission in platelets（MitoTracker Red CMXRos staining，× 400）

2.2 血小板的細胞的凋亡率與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組血小板中的細胞凋亡率明顯升高，差異均具有統計學意義（F=72.435，P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中的細胞凋亡率明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴性，差異均具有統計學意義（F=50.371，P＜ 0.05），見圖2。

圖2 血小板中的細胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate in platelets

2.3 血小板中ROS的水平與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組血小板中ROS熒光強度明顯升高，ROS的水平明顯升高，差異均具有統計學意義（F=47.028，P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中ROS熒光強度明顯降低，ROS的水平明顯下降，并且具有明顯的劑量依賴性，差異均具有統計學意義（F=28.664，P＜0.05），見圖3。

圖3 血小板中ROS的水平（DCDHF?DA染色，×400）Fig.3 The comparison of the levels of ROS in platelets（DCDHF?DA staining，× 400）

2.4 qRT?PCR檢測相關基因的表達與Normal組相比，TMD、rhTPO（低、中、高）組血小板中Opa1（F=10.124）、Bcl?xl（F=9.648）、Mfn2（F=9.771）的mRNA的表達明顯降低，Fis?1（F=11.617）、Drp?1（F=9.258）、Cyt?c（F=10.035）和 Bak（F=9.884）的mRNA的表達明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中 Opa1（F=7.229）、Bcl?xl（F=6.943）、Mfn2（F=6.872）的mRNA的表達明顯升高，Fis?1（F=7.336）、Drp?1（F=6.058）、Cyt?c（F=6.948）和Bak（F=6.325）的mRNA的表達明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴性，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1 、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的mRNA的表達Fig.4 The mRNA expression of Fis?1，Mfn 2，Drp?1，Opa 1，Cyt?c，Bcl?xl and Bak in platelets

2.5 洗滌血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和 Bak 的表達與 Normal組相比，TMD、rhTPO（低、中、高）組血小板中 Opa1（F=11.032）、Bcl?xl（F=10.255）、Mfn2（F=10.682）的表達明顯降低，Fis?1（F=11.967）、Drp?1（F=9.875）、Cyt?c（F=10.524）和 Bak（F=10.147）的表達明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中Opa1（F=8.246）、Bcl?xl（F=7.559）、Mfn2（F=7.127）的表達明顯升高，Fis?1（F=8.539）、Drp?1（F=7.691）、Cyt?c（F=7.484）和 Bak（F=6.724）的表達明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴性，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達Fig.5 The expression of Fis?1，Mfn 2，Drp?1，Opa 1，Cyt?c，Bcl?xl and Bak in platelets

3 討論

臨床上將rhTPO用于實體腫瘤放化療誘導的血小板減少癥以及過敏性紫癜引起的血小板減少的輔助治療中[11]，取得了較為滿意的療效，但是rhTPO如何調控相關基因的表達，抑制血小板的凋亡，尚未有定論[12]。因此深入揭示血小板凋亡的分子機制，對于血小板生成類藥物的開發、推廣都具有重大意義。

輸注血小板是治療重度血小板減少癥的常用方法，療效明顯，但維持時間短，且易出現過敏、高熱、感染等副反應，而TPO是特異性的調控血小板生成的因子，可直接增加血小板的分泌量[13]。但因其儲存、來源等限制了其臨床應用，而基于基因重組技術誕生的rhTPO，能更好的彌補TPO的不足，在各種原因引起的血小板減少癥中發揮作用[14]。MEI等[15]研究顯示將rhTPO用于治療成年免疫性血小板減少癥時，療效顯著，不良反應較少。YAO等[16]研究顯示rhTPO能明顯安全、有效的促進造血干細胞移植患者術后的血小板恢復，不良反應低。本研究結果顯示rhTPO能明顯抑制TMD誘導的血小板凋亡，并且具有良好的劑量依賴性。

線粒體是血小板的“動力源”，消除ROS的重要武器[17]。研究顯示[18-19]細胞內的線粒體處于動態的平衡中，Drp?1、Fis?1以及 Mfn2、Opa1 基因分別是線粒體膜裂解與融合的關鍵調控因子。XU等[20]研究顯示在血小板減少癥患者中的血清中，血小板的線粒體呈現碎片化狀態，凋亡率明顯升高。XIANG等[21]研究顯示及時清除ROS后，能明顯維系血小板線粒體膜結構的穩定，抑制其細胞凋亡。在病理狀態中，凋亡信號被炎癥等激活，Bak的轉錄與翻譯驟增，Bcl?xl的活性受限，誘導血小板的細胞凋亡[22]。MIAO等[23]研究報道對免疫性血小板減少癥進行抗Bak治療，能明顯升高Bcl?xl的表達。本研究結果顯示經rhTPO干預后Opa1、Bcl?xl、Mfn2、Fis?1、Drp?1、Cyt?c和 Bak 基因的轉錄和表達對rhTPO具有明顯的劑量依賴性。

綜合上述，rhTPO能明顯抑制TMD誘導的血小板的細胞凋亡，這可能與抑制ROS的富集，改善線粒體的形態有關，但如何更為有效的將rhTPO用于臨床相關疾病的治療，仍需考慮患者體質的特異性。