胃腸道間質瘤患者Ki-67和鈣激活通道蛋白1表達與預后的關系

陳泓臻 邱惠芳

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是胃腸道常見間葉組織源性腫瘤，好發于胃及小腸，可累及整個消化道，占消化道腫瘤的5%[1]。GIST多伴有血小板源性生長因子α多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）和 v-kitHardy-Zucker-man4貓科肉瘤病毒致癌基因同源物（v-kitHardy-Zuckerman4 of oncogene homolog,KIT）基因的獲得性功能突變，表現為KIT蛋白（CD117）特異性陽性表達[2-3]。GIST生物學行為極為復雜，危險度分級與患者預后情況受多種因素綜合影響[4-5]，危險度分級作為預后、靶向治療及治療年限選擇的評估依據不夠完備，除經典的核分裂象計數、腫瘤最大直徑、轉移及破裂等預后指標外，分子生物學標志物在評估患者進展效能和生存風險等方面也廣受關注。Ki-67是一種反映細胞分裂與增殖活性的核抗原，其高表達與惡性腫瘤分化、浸潤、轉移及不良預后密切相關，作為一種可靠的預后標志物，已應用于肺癌、神經鞘瘤、口腔癌及胰腺神經內分泌腫瘤的預后評估[6-7]。鈣激活通道蛋白1（calcium activated chloride channel1,ANO1）又稱DOG-1蛋白，與Ⅲ型酪氨酸激酶受體信號傳導通路有關，可選擇性高表達于GIST，尤其是KIT蛋白表達陰性GIST患者，能夠有效反映GIST病情進展，對預后評估有潛在應用價值[8]。目前，Ki-67與DOG-1對GIST預后的預測評估作用尚存爭議，兩者與GIST預后的關系尚待進一步驗證。為此，本研究選取107例GIST患者作為回顧性隊列，探討了Ki-67抗原和DOG-1表達水平與預后的關系，以期為臨床評估GIST患者病情進展及預后情況提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取杭州師范大學附屬醫院2018年1月—2021年12月收治的107例GIST患者作為回顧性隊列研究對象。其中男65例，女42例；年齡25～73（57.53±9.87）歲；腫瘤部位：胃67例，腸道40例；腫瘤直徑 1～26（6.58±4.50）cm；腫瘤轉移部位：肝轉移 9例，脾轉移2例，腹盆腔多發轉移1例。納入標準：符合《中國胃腸間質瘤診斷治療共識（2017年版）》[9]的GIST診斷標準，并經病理學檢查確診；免疫組化、臨床診療及隨訪資料完整。排除標準：手術治療前接受化療、放療、靶向治療者；病理診斷不明確者；合并其他嚴重系統性疾病者。收集患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤轉移與否、核分裂象計數、美國國立衛生研究院（National Institutes of Health,NIH）危險程度分級等資料數據。本研究符合世界醫學協會《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

1.2.1 Ki-67和DOG-1表達水平的檢測 采用EnVison兩步染色法。獲取患者經內鏡下或外科手術切除后的標本，以含10%甲醛的飽和碳酸鈣溶液固定，脫水后用石蠟包埋，切片，經過檸檬酸修復液處理，用蒸餾水與PBS緩沖液沖洗后滴加一抗，過夜后再次沖洗；加二抗，37℃孵育后沖洗，進行顯色、封片處理，顯微鏡下觀察。所用抗體Ki-67和DOG-1均購自中國北京中杉金橋生物技術開發有限公司。以PBS代替一抗作為陰性對照，以試劑盒配套試劑為陽性對照。

1.2.2 結果判定 由2名主治病理醫師共同判讀。細胞核呈棕黃色判定為Ki-67陽性表達，選取10個高倍視野（high power field,HPF），統計陽性細胞數占總細胞數的比例并取平均值，＞10%為高表達，≤10%或未染色為低表達。統計細胞質或細胞膜染色的細胞數占總細胞數的比例并取平均值，＞10%為DOG-1陽性表達，≤10%或未染色為陰性表達。

1.2.3 危險程度分級 采用NIH專家組制定的原發GIST手術治療后危險度分級標準，選擇腫瘤細胞生長最活躍區域，連續觀察50個HPF進行核分裂象計數，結合腫瘤大小、腫瘤部位及腫瘤破裂進行綜合評估，分為極低危、低危、中危和高危4級[10]。

1.2.4 隨訪 術后隨訪時間4～50個月，中位隨訪時間31個月，統計隨訪時間內累積生存率。

1.3 統計學處理 使用SPSS22.0統計軟件，計數資料用頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制不同Ki-67和DOG-1表達水平GIST患者的生存曲線并計算累積生存率，采用ROC曲線分析Ki-67和DOG-1水平對GIST患者預后的預測效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67和DOG-1表達與GIST臨床病理特征的關系 Ki-67高表達和DOG-1陽性表達與腫瘤直徑、腫瘤轉移、核分裂象計數、NIH危險度分級密切相關（P＜0.01），見表1。

表1 Ki-67和DOG-1表達與GIST臨床病理特征的關系[例（%）]

2.2 Ki-67、DOG-1表達與GIST患者累積生存率的關系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，Ki-67低表達GIST患者累積生存率高于高表達患者，DOG-1陰性表達患者累積生存率高于陽性患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Ki-67和DOG-1表達水平與GIST患者累積生存率的關系

2.3 Ki-67、DOG-1水平對GIST患者預后的預測效能 ROC曲線顯示，Ki-67最佳截斷值為15.87%，Ki-67表達對GIST預后預測的AUC為0.847（P＜0.01）；DOG-1最佳截斷值為12.58%，DOG-1表達對GIST預后預測的AUC為0.940（P＜0.01），見圖2。

圖2 Ki-67和DOG-1水平預測GIST患者預后的ROC曲線

3 討論

手術切除是原發性GIST的主要治療手段，但術后復發率依然較高，因此，準確、個性化的危險度分級是手術治療后治療年限選擇和靶向治療方案評估的關鍵，直接決定了患者預后程度?，F行廣泛使用的NIH危險度分級標準基于2002年NIH標準腫瘤最大直徑和核分裂象計數，同時吸收美軍病理學研究所標準中腫瘤部位、引入腫瘤破裂等評估參數改良而成，大大提高了GIST預后風險分級的準確性和實用性[11]。但是大量研究表明，NIH危險度分級標準并不適用于所有GIST的生物學行為及臨床轉歸評估，一小部分GIST可快速進展致肝轉移，亦不乏大量高危GIST患者即便術后不接受輔助治療卻依然長期保持無病生存[12-15]。這充分說明了GIST生物學行為的復雜性，患者個體巨大的異質性與NIH危險度分層之間的匹配度不完備，導致NIH危險度分級在臨床實踐中既容易忽視高危GIST群體的內部差異，又容易放大極低危與低危GIST群體間差異。因此，NIH危險度分級標準對GIST預后、靶向治療及治療年限選擇的評估依據依然完備性不足。改進路徑無非兩條，一是持續改進腫瘤最大徑、核分裂象計數、腫瘤部位和腫瘤破裂這4個現有參數的評估方法，二是引入分子生物學標志物等新參數。

GIST預后相關危險因素包括腫瘤大小、核分裂數、腫瘤原發部位和腫瘤是否破裂等，尚沒有特異性生物學標志物反映GIST的惡性潛能。研究發現，Ki-67與細胞增殖有關，在腫瘤組織中表達越高，腫瘤生長速度就越快，而生長速度快慢正是區分腫瘤良、惡性的一個主要特點，提示Ki-67可以作為判斷GIST惡性潛能和預后的一個潛在指標[15]。Ki-67分布于細胞核內，主要表達于細胞分裂周期的M期，G1期、S期較少表達，直接與細胞有絲分裂相關，其表達水平與腫瘤細胞增殖活躍程度、侵襲轉移密切相關[16]。DOG-1是11q13位點上由CCND1-EMS1基因編碼的跨膜蛋白，可參與調控Ⅲ型酪氨酸激酶受體信號傳遞通道，可能是GIST發病的重要機制之一，在GIST中的表達率可達90%～95%[17]。Ki-67和DOG-1作為潛在的危險度分級及預后評價指標，目前已廣受臨床關注。本研究結果顯示，Ki-67高表達和DOG-1陽性表達與GIST腫瘤直徑、腫瘤轉移、核分裂計數、NIH危險度分級密切相關（均P＜0.01），GIST患者累積生存率與Ki-67和DOG-1表達水平密切相關（均P＜0.05）。ROC曲線分析發現，Ki-67和DOG-1表達水平對GIST預后預測的AUC為0.847和0.940（P＜0.01），與Ghadir等[18]的結論較為接近，后者認為Ki-67標記指數（Ki-67 labeling index,Ki-67LI）與核分裂象計數具有相似的應用價值，可以作為高危GIST伊馬替尼延長治療的輔助指征。但目前相關研究分組切點值較多，尚無形成共識性的最佳分組界值。在Al-Zawi等[19]的研究中，Ki-67LI切點值為6%，其對GIST患者無復發生存率預測的AUC為0.814，僅具中等預測效能，AUC值低于本研究以10%為界值的0.847。Boilve等[20]的研究結論卻相反，當Ki-67LI＞8%時，高危GIST延長使用伊馬替尼的獲益會明顯降低。本研究Ki-67的最佳分界值為15.87%，與Soliman[21]認為Ki-67LI≥10%可以作為整體生存率及無病生存率較差的獨立預測因子的研究結果較為一致。本研究表明，DOG-1陽性表達的GIST患者預后更差，累積生存率更低。但是Li等[22]通過一個多中心研究證明，DOG-1和CD117陽性與不同危險度分級之間無明顯相關性，不能作為預測GIST危險度的指標。另外，Akbari等[23]的一個大規模研究顯示，血清DOG-1檢測可以有效反映GIST患者病情進展，手術治療后血清DOG-1水平顯著下降或呈陰性，疾病一旦進展或復發轉移，血清DOG-1便立即升高或轉陽，因此血清DOG-1檢測也被形象地稱為“液體活檢”。總之，DOG-1能否用于預后評估和納入危險度分級尚存爭議，Ki-67要想獲得與傳統核分裂象計數同等地位或取而代之，亦需進一步大樣本、前瞻性的研究作為循證依據。

綜上所述，Ki-67和DOG-1對GIST預后分別具有中等和較高預測效能，可作為重要預后影響因子，結合核分裂象計數和NIH危險度分級綜合評估患者預后，可增進患者獲益。但是，本研究樣本量小、隨訪時間短，加之目前有關Ki-67和DOG-1對GIST預后評估多為單中心研究，尚需更多大樣本、多中心、前瞻性、長時段的研究作為循證依據，才能判定是否將Ki67和DOG-1納入危險程度分層，進一步改進NIH危險度分級標準，增加其準確性和實用性。