巖藻多糖的純化工藝研究

李莉，武成剛，李炎鍇，王柯，張淑平

(上海理工大學 材料與化學學院，上海 200093)

巖藻多糖為天然的褐藻多糖硫酸酯，是一種聚合高分子電解質[1]。多項研究結果表明，巖藻多糖具有降血脂、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，在海洋藥物開發等領域具有巨大的潛力[2-4]。經過回收提取后的褐藻糖膠粗品中往往會含有部分雜質,如K+、Na+、Ca+、Mg+等陽離子及色素等，影響褐藻糖膠的純度并且不利于進一步的深度開發。目前分離純化的方法有膜分離法、樹脂吸附法、電滲析等。朱家慶等采用大孔樹脂法純化葛根多糖，純化后的多糖純度達到55.34%[5]。Tang等采用膜分離技術純化Lentinus edodes水提物中的多糖，得到的總糖含量最高可達86.11%[6]。本實驗以巖藻多糖粗品為原料，利用陽離子樹脂靜態脫鹽，并結合膜過濾系統對巖藻多糖進一步純化，為研究開發巖藻多糖提供依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

離子交換樹脂(001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂)由上海華羚樹脂有限公司提供；濃硫酸、苯酚、過氧化氫均為分析純；巖藻多糖(由海帶中制備，粗品含量15%以上)。

JS-XS-T-02C-01膜過濾實驗設備；膜(截留分子量為300的納濾膜)由江蘇久吾高科技股份有限公司提供；HY31-01型電熱恒溫水浴鍋；UV-1600型紫外可見分光光度計；PHS-3C型pH計；DDS-307型數字電導率儀；NDJ-5S數字式粘度計；RE-201旋轉蒸發器；DZF-6030A型真空干燥機；SXL-1216型程控箱式電爐。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻多糖粗品的預處理 稱取約1.3 kg固體樣品，加入15倍固體量的去離子水溶解，取上清液進行實驗。

1.2.2 陽樹脂靜態法脫鹽[7]

1.2.2.1 陽樹脂的篩選 當分離無機陽離子時一般選用陽樹脂，不同類型的陽樹脂其結構參數見表1。由于巖藻多糖呈弱酸性，應在酸性條件下被吸附，強酸型陽離子交換樹脂主要含有強酸性的反應基如磺酸基(—SO3H)，可以用于交換所有的陽離子。而強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂中001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂常用于制藥制糖工業，所以本實驗主要采用001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂來進行靜態法脫鹽。

1.2.2.2 陽樹脂的處理 用水將樹脂充分膨脹后使用70～80 ℃的熱水反復清洗，采用酸-堿-酸的方式將陽樹脂進行活化處理，再用去離子水將樹脂洗至中性，待用。樹脂長期使用會被不同程度的污染，需根據情況對樹脂進行不定期處理。

1.2.2.3 脫鹽 量取5 L上述液體，按料液比為0.25∶1，0.5∶1，0.75∶1，1∶1等加入處理好的陽樹脂進行脫鹽，并不停攪拌，使離子充分交換。每隔15 min 測定液體的電導率、pH值、粘度、密度，確定陽樹脂的最佳添加量。

表1 樹脂的結構參數Table 1 Structural parameters of resin

1.2.3 過氧化氫脫色[8]將上述脫完鹽的多糖溶液，采用過氧化氫法進行脫色。在單因素實驗的基礎上確定了最佳的實驗參數為：過氧化氫的添加量為8%，60 ℃水浴，每隔1 h測定吸光度值，確定最佳脫色時間和計算脫色率。

1.2.4 納濾[9]將上述多糖溶液繼續純化，采用膜分離系統。

1.2.4.1 膜的篩選 粗多糖中具有很高的鹽含量，采用納濾工藝對多糖進行濃縮時，膜材料和截留分子量的選擇十分關鍵。首先關于材料主要選用芳香聚酰胺類納濾膜，截留分子量的大小應確保有效組分多糖的全部截留，同時又能保證多糖中鹽分的透過，降低運行壓力等。本實驗主要選用截留分子量為300的納濾膜，可以很好地保留糖類，去除雜質。

1.2.4.2 膜的預處理 將膜清洗后，加入去離子水實驗，達到表2條件方可使用。

表2 納濾膜使用條件Table 2 Conditions of use of nanofiltration membranes

1.2.4.3 過納濾膜 將巖藻多糖溶液倒入不銹鋼桶內，加入1倍體積去離子水，按操作要求開啟機器。加入去離子水后約5 min測定濾出液的pH、電導率和桶內液體溫度。當桶內液體體積為原先體積的1/2時(約40 min)，加入1倍體積去離子水。直至加入去離子水，濾出液的電導率相對穩定時，結束實驗。為防止桶內液體溫度過高，適時加入冰袋降溫，控制溫度在45 ℃以內。

1.2.4.4 納濾膜污染與清洗 在膜分離過程中因為多糖和雜質的影響納濾膜會出現一定程度的污染，按技術要求清洗機器，達到表2要求方算清洗干凈。

1.2.5 干燥樣品 取出樣液用旋轉蒸發器濃縮至約1 L，加入乙醇沉淀，靜置一夜。取出沉淀先用鼓風干燥去除大部分乙醇后，再真空冷凍干燥制得樣品。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 巖藻多糖含量的測定[10]使用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖做標準曲線，其中回歸方程為y=37.829x-0.013 4，r2=0.995 5。

1.2.6.2 脫色率的計算 以蒸餾水作為空白對照，測定溶液色度。

式中p1——脫色前溶液的吸光度值；

p2——脫色后溶液的吸光度值。

1.2.6.3 電導率的測定 采用數字電導率儀測定。

1.2.6.4 pH的測定 采用pH計進行測定。

1.2.6.5 粘度的測定 采用數字式粘度計進行測定。

1.2.6.7 水分測定[11]取干凈的稱量瓶稱取一定樣品放入烘箱中，在一定的溫度(95～105 ℃)和壓力(常壓)下加熱干燥樣品，蒸發掉樣品中的水分，稱量樣品干燥前后的質量，質量差即為樣品的水分含量。計算公式為：

式中m0——稱量瓶的質量，g；

m1——稱量瓶和樣品的質量，g；

m2——稱量瓶和干燥后樣品的質量，g。

1.2.6.8 灰分測定[11]用灼燒至恒重的坩堝稱取一定樣品，將樣品完全炭化后于500～600 ℃高溫爐中灼燒，樣品中的碳、氫、氧、氮等元素以二氧化碳、氮氧化合物及水分等形式而放出，無機物則會以無機鹽和金屬氧化物的形式殘留下來，殘留下來的物質即為樣品中所含灰分，稱量殘留物的質量以計算樣品中總灰分的含量。計算公式為：

步驟4：進行特征值分解，然后依據信號子空間和噪聲子空間的正交性，進行譜峰搜索，最終得到DOA估計結果.

式中m1——坩堝的質量，g；

m2——樣品和坩堝的質量，g；

m3——殘留物和坩堝的質量，g。

2 結果與討論

2.1 陽樹脂脫鹽效果

由于海洋生物制品含有較多的Na+、Mg2+等陽離子，影響其純度，進而影響其生理活性，因此需要將雜質離子除去。本實驗采用陽離子交換樹脂，可以交換陽離子物質。

R-X--Y++A+?R-X--A++Y+

其中，R代表離子交換劑的高分子聚合物基質，X-代表陽離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團，Y+代表陽離子交換劑的平衡離子，A+代表溶液中的離子基團[12]。

由于一個H+交換一個Na+，兩個H+交換一個Mg2+，因此，溶液中離子濃度降低，又由于電導率可以反應溶液中的離子濃度；同時，H+交換下Na+、Mg2+等陽離子進入溶液，使溶液的pH值下降，所以可以根據溶液電導率和pH值的變化情況來判斷離子交換過程和脫鹽效果。又由于離子交換樹脂交換離子的同時還可以吸附溶液中的色素和其他雜質，使溶液粘度和密度有所下降，因此本實驗采用測定溶液粘度和密度的方法輔助判斷陽樹脂脫鹽的過程和效果。

由表3可知，加入陽離子交換樹脂后溶液的pH值顯著下降，這是由于大量的H+進入到溶液中。電導率雖有所下降，但下降得不明顯，這是由于一個H+交換一個Na+，兩個H+交換一個Mg2+，對于離子濃度影響不是很明顯。從粘度和密度數據可知，此兩個指標也呈下降趨勢。觀察料液比數據，隨著陽離子樹脂的加入，各指標下降趨于緩慢，說明脫鹽過程已趨于結束。由于處理樹脂的過程復雜且需要大量去離子水，從節約方面考慮，可以選擇0.75∶1為最佳料液比。

表3 陽樹脂脫鹽各指標測定結果Table 3 Determination results of each index of cation resin desalination

2.2 過氧化氫脫色效果

過氧化氫脫色主要因為過氧化氫帶有過氧鍵，過氧鍵斷裂而生成的過氧自由基奪電子能力強，有強氧化性。因此過氧化氫與色素作用時，有色物質的分子被氧化褪色，從而可以起到脫色作用[13]。

圖1 過氧化氫脫色效果圖Fig.1 Hydrogen peroxide decolorization effect diagram

由圖1可知，加入過氧化氫后，溶液的色度下降，尤其在前2 h內最為明顯，在6 h時趨于穩定，此時的脫色率為50.95%。

2.3 納濾效果

膜過濾是一種與膜孔徑大小相關的，以膜兩側的壓力差為推動力的篩分技術，以膜為過濾介質，在一定的壓力作用下，原液中的水和小分子等通過膜表面上微小的孔隙而成為透過液，原液中體積大于膜表面微孔的物質留在膜的進液側，成為濃縮液，通過膜過濾技術可以實現對原液的分離和濃縮[13]。本實驗采用納濾膜進行脫鹽。

由表4可知，濾出液電導率隨著脫鹽實驗的進行而降低，當加入11倍體積樣液去離子水時，濾出液電導率趨于穩定，可視為脫鹽結束。溫度和流量的記錄是為了納濾系統的正常運行。

脫鹽前后樣液的電導率從25.08 mS下降到5.32 mS，pH從2.89上升至4.04，脫鹽率達到78.79%。

表4 納濾實驗各指標記錄Table 4 Records of each index of nanofiltration experiment

2.4 樣品各指標的測定

對純化得到的巖藻多糖樣品指標進行測定，結果見表5。純化后樣品的總糖含量為47.41%，水分含量為8.12%，灰分含量為25.09%，濃度為2.011 mg/mL 的樣品溶液pH值為5.69，電導率為0.31 mS。

表5 樣品各指標測定結果Table 5 Determination results of each index of the sample

3 結論

(1)過氧化氫脫色是相對溫和的脫色方法，其脫色效果好，可適用于實驗室大量樣品的脫色。

(2)本實驗采用陽離子交換樹脂進行脫鹽的同時，樹脂對色素及其他雜質也有一定的吸附作用，純化作用明顯。

(3)膜分離技術只用壓力作為膜的推動力，分離裝置簡單，易于操作，同樣適用于實驗室大量樣品的純化。其中，膜是技術關鍵，可根據實驗要求，選擇不同類型和規格的膜。本實驗采用傳統的樹脂脫鹽與先進的膜分離技術相結合，能更好地除去樣品中的雜質，并且適用于其他多糖的分離純化。

(4)通過此純化工藝得到的巖藻多糖純品，其多糖含量為47.41%，水分含量為8.12%，灰分含量為25.09%，濃度為2.011 mg/mL的樣品溶液其pH值為5.69，電導率為0.31 mS。