湛江高橋紅海欖群落樣方遺傳相似性特征研究

謝秀琴 黃劍堅

遺傳多樣性，又稱為基因多樣性，開展遺傳多樣性的研究對森林可持續管理、保護生物多樣性、維護森林生態服務功能有積極的意義[1～2]。遺傳多樣性賦予樹木必要的適應性，使其能夠在時間和空間上可變的環境中可持續存在[3]。研究者指出，雜合子頻率的增加有利于該物種的管理，維持具有高雜合性水平的繁殖個體的種群有利于種群動態和結構的維持[4]。有研究者建議采取措施促進維護遺傳多樣性，將其作為生態系統的組成部分[5～7]。而選擇性伐木可能導致特定基因和整體遺傳多樣性的喪失，影響森林穩定性[8]，主要原因為砍伐導致有效種群數量減少，從而導致等位基因的喪失并限制了交配的可能性[5]。可見，遺傳多樣性的研究對于森林經營和生態恢復至關重要。

紅樹林泛指在熱帶與亞熱帶地區的海岸潮間帶灘涂上生長的木本植物群落，其消浪護岸、生物多樣性保護等多種生態服務功能是陸地森林所不可取代的[9]。目前，個體層次的紅樹林遺傳多樣性研究多從大尺度和中尺度層面開展[10～11]，小尺度的研究較為少見。紅海欖Rhizophora stylosa屬紅樹科的紅樹植物，為常綠灌木或小喬木，支柱根極為發達，通常形成純林，主要分布于廣西、廣東和海南等地，是沿海紅樹林生態恢復的優選樹種[12]。本項目擬選擇廣東湛江紅樹林國家級自然保護區高橋紅樹林區中的紅海欖作為研究對象，從遺傳多樣性的重要指標——遺傳相似性角度出發，開展紅海欖群落樣方遺傳相似性特征研究，旨在為完善生物多樣性保護、維護森林生態服務功能、開展紅樹林生態恢復等提供新的參考。

1 研究區域

高橋紅樹林區是廣東湛江紅樹林國家級自然保護區的核心區，其位于廉江市高橋鎮紅樹林大道，面積超過1 200 hm2，是我國最大的紅樹林自然保護區。其中有高等植物19 種，浮游植物97種，底棲硅藻159種，魚類85種，貝類91種，蝦蟹62種，浮游動物27種，鳥類170多種[13]。該紅樹林小區屬于亞熱帶季風氣候，年降水量1 550 mm左右[13]。

2 材料與方法

2.1 樣地調查與植物葉片樣品采集

對高橋紅樹林區20 m×20 m 天然紅海欖純林樣地進行植物群落調查。先用GPS 測量樣地西南角的地理坐標，再以該點為坐標原點，用鋼尺測量每株樹木在樣地內的坐標（x，y），在樣木位置圖上標記調查木的編號。然后，對樣地內樹木進行每木調查，記錄樹種、樹高、胸徑、距離等林分因子，起測胸徑3 cm。隨機采集樣方內的每一株紅海欖的健康葉片10 片，裝進密封袋，做好標記，放進裝有冰袋的保溫箱，帶回放在溫度-80℃冰箱保存待測。

群落樣方位于鳳地村，樣方僅有26 株古老的紅海欖，平均樹高5.12 m，平均地徑5.43 cm，平均冠幅7.47 m，處于群落演替的后期。

2.2 測試方法

選取紅海欖嫩葉為基因組DNA提取材料，采用經改進的CTAB法[14]提取紅海欖基因組DNA，溫度-20℃保存備用。提取DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測紅海欖基因組DNA質量。

實驗采用的均是上海生工公司合成的引物。ISSR（Inter-simple sequence repeat）引物為加拿大哥倫比亞大學所公布的第9套ISSR引物。從70 個ISSR 引物篩選出擴增效果好、條帶清晰、具有多態性的引物。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）引物參照LI G[15]已開發的引物序列。引物按照完全隨機組合的原則，共組合120對。隨機選取4個材料的DNA進行引物篩選，利用3%瓊脂糖凝膠電泳進行引物初選，較好的引物組合利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行復選。

本實驗采用的均是10 μL的PCR反應體系，其中包括5 μL 2×PCR StarMix、3 μL ddH2O、1 μL紅海欖模板DNA和1μL引物。ISSR-PCR擴增條件為94℃預變性5 min；94℃變性35 s，58℃復性35 s，72℃延伸30 s，35 個循環；然后72℃延伸10 min；20℃保存。SRAP-PCR 反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，共5個循環；隨后94℃變性30 s，49 ℃復性50 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸7 min；20 ℃保存。將PCR擴增產物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后利用銀染法顯影固定出清晰的條帶。

2.3 數據統計分析

根據清晰可重復的原則，按照同一遷移位置的條帶的有無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立二元數據矩陣，輸入Excel表格中，利用NTSYS 2.02軟件計算遺傳相似系數（genetic similarity，GS），遺傳距離指數則為D=1-GS。對樣方內26 株紅海欖單株進行UPGMA聚類分析，然后建立系統發育樹。根據UPGMA聚類分析來分析群落樣方紅海欖的基因流圖。

2.4 遺傳一致性評價方法

GS<0.20 代表同個樹種不同單株間遺傳相似度極低，親緣關系極遠；0.20

GS最大值和最小值的差值為遺傳相似極差（genetic similarity range，簡稱GSR），GSR 表示遺傳相似變動的最大范圍。GSR<0.20 代表分子林分整體遺傳相似變動度極低；0.20

GS的平均值（genetic similarity average，簡稱GSA）表示分子林分整體遺傳相似度，GSA<0.20 代表分子林分遺傳相似度極低；0.20

2.5 種群分布格局測度方法

聚集度指標主要采用包括擴散系數C、叢生指數I、Cassie.R.M.指標CA、負二項參數K、平均擁擠度m*、聚塊性指數指標m*/，詳細計算方法見文獻[16]。

3 研究結果

3.1 紅海欖多態性位點分析

將種內個體間有堿基差異的位點定義為多態性位點（polymorphic site），作為種內多態性的標志。從70個ISSR引物中篩選出10個多態性好、條帶清晰的引物進行PCR擴增，其中具有多態性的位點有60個（表1，圖1），多態性位點百分率為82.2%，平均每個引物產生6個多態性位點。從120對SRAP引物中篩選出14對多態性好、條帶清晰的引物組合進行PCR擴增，其中具有多態性的位點有88個（表2，圖2），多態位點百分率為79.3%，平均每對引物組合產生6.3個多態性位點。擴增出的片段大小均在1 000 bp以下，個別片段在50 bp以下。

圖1 ISSR引物880的PCR擴增

圖2 SRAP引物組合M11E10的PCR擴增

表1 ISSR引物序列及多態性位點

表2 SRAP引物組合及多態性位點

3.2 紅海欖遺傳相似性特征分析

利用NTSYS 2.02軟件將ISSR和SRAP標記合并的多態信息計算出遺傳相似系數，對樣方內26株紅海欖單株進行遺傳相似性分析。由表3可得，供試材料兩兩間的遺傳相似系數范圍為0.327～0.741，表明樣方內26株紅海欖單株之間的親緣關系為遠和較近的分布區間；平均值為0.563，說明分子林分遺傳相似度中等；差值為0.414，說明分子林分遺傳相似變動度中等。紅海欖14和紅海欖16間的遺傳相似系數最大，為0.741，說明兩者在樣方中親緣關系最近；紅海欖15和紅海欖10間的遺傳相似系數最小，為0.327，說明兩者間具有較大的遺傳分化，在樣方中親緣關系最遠。

表3 紅海欖分子林分遺傳相似系數

對樣方內26 株紅海欖單株進行UPGMA聚類分析，得到親緣關系樹狀圖（圖3）。由此可得，在相似系數0.55 的水平下，26 株紅海欖單株主要分為3個類群：1）紅海欖2、11和12 聚為一個類群，遺傳相似極差為0.17，遺傳相似變動度極低；遺傳相似平均值為0.624，遺傳相似度高。2）1、3、5、9、10、19、26為一個類群，遺傳相似極差為0.183，種群遺傳相似變動度極低；遺傳相似平均值為0.589，種群遺傳相似度中等。3）其余4、13、14等16株紅海欖單株為第三類群，遺傳相似變動度極低和遺傳相似度高。遺傳相似變動度為第三類群>第二類群>第一類群；遺傳相似度為第一類群>第二類群>第三類群。群落樣方以第三類群為優勢種，占據環境資源更多，第一類群最少，為弱勢類群。總體上3個類群之間存在一定的基因交流。

圖3 基于ISSR和SRAP的紅海欖UPGMA聚類圖

在相似系數0.60的水平上可分為8類：紅海欖單株2和單株26各單獨為一類，1和3為一類，5、9、10與19為一類，6、18、21和22為一類；20、24和25為一類，11與12為一類，其余4、13、14等9株為一類。同個樣方內的紅海欖不同單株分屬于不同的類群。

3.3 紅海欖不同種群遺傳相似性分布特征

相似系數0.55的水平下紅海欖類群分布格局有所不同（表4）。結合紅海欖遺傳相似性特征分析結果可知，聚集程度越強，種群遺傳相似度越高，種群遺傳相似變動度越低。

表4 相似系數0.55水平不同紅海欖類群的分布格局

4 討論

生物遺傳多樣性是物種適應復雜的環境變化和長期生存下來的重要遺傳基礎。目前紅樹林遺傳多樣性的研究多從大尺度和中尺度的角度研究不同地理種源的遺傳多樣性[10，17]。本文從小尺度通過ISSR和SRAP兩種標記方法開展紅海欖遺傳相似性研究，并結合了分布格局開展了不同類群遺傳相似性分布規律分析。初步研究結果表明，廣東高橋紅樹林區樣方內的紅海欖具有較高的多態性位點百分率，遺傳多樣性較為豐富，紅海欖單株之間處于親緣關系為遠和親緣關系為較近的分布區間，遺傳相似度中等，遺傳相似變動度中等。高橋紅海欖純林為成熟林，樹齡為70～80 年，處于群落演替的中后期，林下更新幼苗較少，紅海欖群落樣方的平均遺傳相似度為0.563，遺傳相似度中等，是合理的。

在相似系數0.55的水平下紅海欖群落樣方類群分為3大類，說明可能有來自其他區域的紅海欖種群，樣方內的紅海欖類群在遺傳上有較大差異。在三大紅海欖類群的交叉影響下，紅海欖群落樣方遺傳相似度中等，遺傳相似變動度中等，結果可信。肖蘭[18]和鄒禎[19]等開展了紅樹林小尺度的空間遺傳結構研究，結果表明紅樹林樹種秋茄樹Kandelia obovata、白骨壤Avicennia marina和紅樹Rhizophora apiculata等純林和混交林具有高水平的遺傳多樣性，純林并未因為物種單一而出現遺傳上的負面效應。本文研究結果與肖蘭[18]和鄒禎[19]對比，直接驗證了即使是紅樹林純林也具有較大遺傳分化的研究結果，這可能得益于其他區域的紅海欖種群的胎生繁殖體漂流到廣東高橋紅海欖區域，建立了目前3個紅海欖類群的純林群落樣方。有研究[20]指出，生境破壞和破碎化提高了親緣關系相近物種之間的交配，長期發展可能會導致近交衰退，進而降低種群的適合度。由于紅樹林為陸海潮間帶的森林，不同地區種源的胎生繁殖體能通過漂流進行交流和定植[11]，即使是純林或者小群落，也不一定因生境破壞和破碎化而提高親緣關系相近物種之間的交配。

與前人的研究對比，本文提出了遺傳相似性結合了種群分布格局的研究方法，更深入分析了群落樣方內紅海欖不同種群遺傳相似性與樹種分布格局之間的關系。本文研究結果表明，三大種群呈現出聚集程度越強，種群遺傳相似度越高，種群遺傳相似變動度越低的規律。這是目前大部分紅樹林遺傳多樣性研究并未報道的研究結果，該結果可為紅樹林的經營管理以及生態恢復提供重要的參考。本文只研究了一個20 m×20 m 的高橋紅海欖純林典型樣方，可能還存在樣本不足的問題。以后的研究將在不同區域、不同紅樹林樹種的不同樣帶設置3個以上樣方，開展不同潮帶小尺度紅樹林遺傳多樣性的分布規律和影響機制等相關研究。同時，本研究采用ISSR和SRAP兩種標記方法開展研究，相對于基因測序技術，ISSR 和SRAP擴增得到的數據非常有限。但是，ISSR和SRAP兩種標記方法較為簡單，方法更為成熟，不需借助昂貴的儀器設備，普通實驗室可以快速以更低的成本初步開展紅海欖遺傳相似性的研究，驗證最初的猜測，得到較為理想的結果，以便開展往后的深入研究。往后的研究需要借助測序技術，完成紅海欖全基因組的測序，以及開展重測序，更深入了解中國紅海欖的遺傳多樣性特征。

5 結論

高橋紅海欖分子林分具有較為豐富的遺傳多樣性，分屬于不同的類群，在遺傳上有差異性，存在一定的基因交流；親緣關系為遠和較近之間，遺傳相似度和變動度中等，以第三種群為優勢種，第一種群為弱勢種群，而一個區域或者同個采樣地的同個樹種可能存在多個種群。初步證明紅海欖種群聚集度與遺傳相似度成正比，與種群遺傳相似變動度成反比。因此，在當前高橋紅海欖林的ISSR/SRAP分子標記方法研究基礎上，將采用重測序的方法，在天然林和人工林開展下一步的遺傳多樣性分析工作，為營造近自然的人工生態林，調整單一種群的紅海欖人工林提供有效的理論指導。

注：圖片均為作者自攝自繪