小分子化合物重編程體細胞的研究進展

□許婷婷 劉 瑋 趙著梅

一直以來，已分化的體細胞被認定為細胞發育的最終階段，并且此過程是不可逆的。但是，細胞重編程技術打破了傳統的思維。1964年，J.B.gurdon先把未受精卵的細胞核破壞，然后把蝌蚪上皮細胞中的細胞核注入，最終形成了正常的蛙。1997年，研究者通過細胞核移植技術把哺乳動物羊的體細胞逆轉錄為全能的胚胎狀態，克隆羊“多莉”因此誕生。2001年，M.Tada用細胞融合技術建立了體細胞重編程體系。2006年，Takahashi和Yamanaka用逆轉錄病毒把Oct4、Sox2、Klf和c-Myc四個轉錄因子在小鼠成纖維細胞上過表達形成誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。至此，細胞重編程經歷了細胞核移植技術、細胞融合技術、體細胞誘導技術的發展歷程。其中，核移植和細胞融合技術涉及倫理問題并存在免疫排斥，轉錄因子的使用增加了基因突變的風險。所以，研究者們開始探索更安全、更高效的重編程技術。因為小分子化合物具有可以自由進入細胞膜、容易合成、價格低廉、容易調控、生物可塑性好等優點，故小分子化合物誘導重編程技術成為研究者們新的研究方向。本文就小分子化合物誘導的不同細胞重編程的類型進行綜述，旨在為以后的研究提供借鑒。

一、小分子化合物誘導多能干細胞

通過調節特定的細胞通路，小分子化合物可以參與細胞的信號轉導、轉錄、代謝等，從而調控細胞重編程的過程。目前，小分子化合物VPA、CHIR99021、repsox、forskolin等被發現在促進iPSC誘導形成中能發揮重要作用。其中丙戊酸(valproicacid，VPA)是最早被發現的能促進iPSC誘導的化合物，研究表明[1]，VPA可以提高誘導重編程的效率(其中三因子重編程可以提高50倍，四因子重編程可以提高100倍)，主要由于通過推動組蛋白乙酰化而改變細胞的轉錄活性來實現。通過一種p53抑制劑的小分子復合物cyclic pifithrin-a，人尿路來源的細胞誘導效率可以被顯著提高約170倍以上。裴端卿研究組還發現一種小分子化合物A-83-01(TGF-β信號通路的抑制劑)，可以通過推動間充質-上皮之間轉化(MET)，縮短誘導的時間來促進重編程。研究者使用VPA和CHIR99021(CHTR)處理鼠成纖維細胞(mouse embryonicfibroblasts,MEFs)，然后用轉錄因子Oct4/Sox2/Klf4轉染Oct4啟動子驅動綠色熒光蛋白(Oct4 promoterdriven green fluorescent protein,OG)標記細胞,可以顯著提高誘導重編程的效率。

上皮-間質轉化(EMT)在胚胎發育、組織重建、癌癥等疾病中發揮了重要作用。在此轉化過程中，TGF-β信號通路發揮了重要作用。但是生成iPSC需要逆轉化，也就是間質-上皮轉化(MET)，所以抑制TGF-β信號通路在EMT中的作用，即抑制EMT、促進MET，利于形成iPSC。TGF-β信號通路是一個龐大的細胞因子家族，包括了接近30種配體。有研究發現SB431542小分子化合物就可以通過抑制TGF-β信號通路下游的Samd2和Samd3，促進MET、提高編程效率而生成神經胚。

BIX-01294可以與一種L型通道鈣離子興奮劑BayK8644一起彌補轉錄因子Sox2缺失帶來的影響，從而提高重編程的效率[2]。鄧宏魁實驗室使用了一個Oct4轉錄因子，又加入了VPA、CHIR99021、Repsox、Parnate4種小分子組合，誘導出了小鼠iPSCs,提高了安全性，也為小分子化合物重編程奠定了基礎[3]。研究者發現，在沒有Oct4基因表達的情況下，D4476，2-甲基5-羥基色胺和福斯科林(Forskolin,FSK)等小分子化合物再加上轉錄因子Sox2、Klf4、c-Myc，能夠把OG-MEFs誘導重編程為iPSCs，所以小分子化合物可以代替Oct4實現細胞重編程。小分子化合物加轉錄因子可以實現重編程，但完全化學重編程還沒有實現，研究者們一直在努力探索，終于Hou等在實驗時發現，用小分子VC6T和FSK組合(VC6TF)處理細胞后，16d加入DZNep(VC6TFZ)可以獲得更多GFP陽性克隆。通過檢測，這些克隆基因表達水平低于胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)的表達水平。將這些克隆經VC6TF處理28d后轉移到絲裂原活化蛋白雙重抑制和糖原合酶激酶-3培養基后，GFP陽性克隆逐漸變為ESC樣形態。研究者將形態為ESC樣、GFP陽性的克隆命名為化學誘導多能干細胞(Chemically induced pluripotent stem cells,CiPSCs)。最后經過研究者優化，發現想要生成CiPSCs，必須具備4個基本的小分子化合物(C6FZ)。2015年，鄧宏魁實驗室[4]報道了生物試劑BrdU的重要作用，不僅可以提高誘導細胞重編程的效率，還可以替代轉錄因子Oct4，與小分子化合物組合實現CiPSCs。實現完全化學重編程使用的化合物最少的組合為：CHIR99021、BrdU、Forskolin、Repsox，通過檢測，誘導產生的CiPSCs具有胚胎干細胞的特性，并且證實BrdU不會產生基因組的不穩定以及基因突變。BrdU成為研究完全化學重編程重要的候選化合物，利于iPSC的臨床應用。

二、小分子化合物誘導細胞轉分化

在iPSCs誘導重編程技術的研究中，研究者先后利用不同的轉錄因子把體細胞直接誘導重編程為神經細胞、心肌細胞等等。同樣，在小分子化合物誘導重編程的研究中，小分子化合物直接誘導重編程體細胞為神經細胞、心肌細胞等也開始被研究探索。

(一)小分子化合物誘導形成神經細胞。2014年，Cheng等在生理缺氧(5%O2)，不引入外源基因的條件下，使用3種小分子VPA、CHIR99021和Repsox可以誘導小鼠尾尖成纖維細胞(TTF)、MEFs產生神經前體細胞(ciNSC)。Zheng等發現使用4種小分子(VPA、A83-01、Thiazovivin、Purmorphamine)可以將MEF轉化為神經干細胞(neural stem cells,NSCs)。在組合中，GSK-3β抑制劑(CHIR99021)激活β-catenin信號通路增強HES1的表達從而誘導生成NSCs，還可以激活Wnt信號通路，利于NSCs的外胚層分化為運動神經元。CHIR99021還可以協同其他的小分子化合物提高誘導神經方向重編程的效率。VPA(丙戊酸)通過調控Wnt信號通路促進NSCs向神經元轉化，也可以通過遺傳調節提高誘導重編程的效率。1980年在果蠅身上發現的Shh信號通路具有調控增殖和組織分化的作用，并且在神經系統的發育中起著重要作用。Purmorphamine是一種Shh信號通過的激活劑，可以誘導小鼠胚胎干細胞向神經方向分化。Pei等使用了7種小分子VCRFSGY(VPA、CHIR99021、Repsox、Forskolin、SP600125、GO6983、Y-27632)直接誘導重編程人成纖維細胞為人化學誘導神經元(hciNs)。在小分子化合物組合中，Forskolin可以通過神經元素2將人成纖維細胞重編程為膽堿能神經元。SP600125能夠促進轉錄因子Oct4重編程人成纖維細胞分化為神經細胞。Y-27632可以協助維持神經元的存活和干細胞的多向潛能性。另外有研究小組使用6種小分子(VPA、CHIR99021、Repsox、Forskolin、I-BET151、ISX9)可以在12d內將人的星形膠質細胞誘導成功能性的神經元，且轉化率為8%。2013年，Deng等使用VC6TO(VPA、CHIR99021、616452、tranylcypromine、OACI)將MEF重編程為星形膠質細胞。

(二)小分子化合物誘導形成心肌細胞。2014年，Wang等在MEFs中轉染導入轉錄因子Oct4，并且在細胞培養基中加入小分子化合物組合(CHIR99021、SB431542、parnate、forskolin)，結果發現MEFs重編程為心肌樣細胞。與此同時，也有研究者完全用小分子化合物直接重編程MEFs誘導形成心肌樣細胞。2015年，FU等發現在細胞培養基中加入小分子化合物組合(CHIR99021，RepSox，Forskolin，VPA，Parnate，TTNPB，DZnep)可以直接將MEFs重編程為心肌樣細胞，經過后續實驗檢測這些誘導形成的細胞能夠特異性表達心肌的標志物，有典型的電生理特點和鈣流動。該研究為治療心衰等心肌細胞損傷疾病奠定了基礎。研究者在篩選不同的小分子組合，發現有7種(CHIR99021、AS8351、A8301、BIX01294、SCI、OAC2、Y27632)小分子化合物可以將人包皮成纖維細胞誘導分化為心肌樣細胞。為了進一步證實該細胞是否具有心肌細胞的特性，研究者在誘導形成的細胞中加入SU16F和JNJ10198409(此為血小板衍生生長因子通路抑制劑)，結果發現，在誘導的第20d可以明顯觀察到跳動的細胞群落，之后通過電鏡，還可以觀察到H帶、肌節等超細顯微結構；在誘導的第40～45d，可以檢測到細胞具有跟心室肌細胞相似的動作電位。研究證明，小分子化合物完全可以誘導成纖維細胞為心肌樣細胞。

三、結語

細胞的直接重編程不需要經過iPSC這一中間階段，而是直接把一種分化成熟的細胞(如體細胞)編程為另一種分化成熟的細胞(如神經元)的過程。這種方法由于不用經過中間階段，所以所需時間短、更加安全，更容易應用于臨床。目前，在人和鼠物種體內，小分子化合物重編程體細胞已經實現，通過誘導可以獲得CiPSCs、hciNs、心肌樣細胞等，這些細胞為疾病的臨床治療帶來了曙光。但是小分子化合物重編程的效率還有待提高，此外，小分子化合物重編程的機制還需要進一步明確。相信在不久的將來，重編程的機制明確后，就可以篩選出更安全、更可靠的小分子化合物重編程形成種子細胞。小分子化合物誘導重編程體細胞在其他哺乳動物的研究較少，這也是未來探究的領域和方向。