電針對睡眠剝奪模型大鼠學習記憶能力和Beclin1、LC3B、PI3K及Akt的影響?

游明燦， 陳新旺， 游言文， 郝 莉

(1.鄭州大學第一附屬醫院， 鄭州 450052；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院， 鄭州 450003；3.河南中醫藥大學醫學院， 鄭州 450046)

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由多種原因引起的個體睡眠時間減少。SD是現代社會普遍存在的問題，影響著全世界數百萬人的生活[1]。研究表明，SD可引起人的學習記憶能力下降[2-5]。海馬是與學習記憶相關的重要腦區[6]。SD可通過神經炎癥、氧化應激、細胞凋亡和自噬等病理機制引起海馬神經元的損傷[7]，進而影響學習記憶。目前，尚未有改善SD的有效藥物。因此，尋找安全、有效治療SD的方法成為當務之急。

自噬是一種細胞內受損細胞器和蛋白質降解并回收利用的過程，它有助于維持細胞正常結構和生理功能[8]，但過度自噬又可導致細胞損傷。已有實驗證實，SD能使神經元發生過度自噬，繼而引起細胞凋亡和死亡。抑制神經元過度自噬和凋亡，可改善SD小鼠的認知障礙[9]。有學者提出，調節磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路，可減少海馬神經元過度自噬和凋亡，減輕神經損傷，從而改善SD相關的學習記憶障礙[10，11]。另外，抑制小鼠海馬神經元過度自噬，同時激活PI3K/Akt信號通路，可改善SD小鼠的學習記憶障礙[12]。

針灸作為一種傳統的中醫療法，已成為世界上應用較廣泛的替代醫學療法之一，而且具有并發癥少、安全性高和費用較低等優勢。近年來，針灸已用于SD的臨床治療，可改善患者的認知功能，減輕臨床癥狀[13]。但是其中具體的分子作用機制尚未闡明。因此，本研究擬通過體內實驗觀察電針百會和大椎穴對改良多平臺水環境法，誘導建立SD模型大鼠學習記憶能力的改善作用和對肌球蛋白樣BCL2結合蛋白(myosin-like BCL2 interacting protein，Beclin 1)、微管相關蛋白1輕鏈3 B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta，LC3B)、PI3K和Akt的影響，以期為電針臨床應用于治療SD奠定相應的理論和實驗基礎。本研究通過河南中醫藥大學第三附屬醫院醫學倫理委員會批準(批號LLBH-20210309)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Sprague Dawley大鼠27只2月齡，體質量(260±20)g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK豫2017-0001。動物飼養于河南中醫藥大學東明路校區動物房中，環境溫度為(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝夜12 h光照/12 h黑暗，動物可自由進食和進水。

1.2 主要試劑及儀器

一抗Beclin 1(貨號ab207612)、LC3B(貨號ab48394)、PI3K(貨號ab139307)、Akt(ab179463)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)(貨號ab81283)、二抗(貨號ab6721)，英國Abcam公司；內參(貨號BA0056)，武漢博士德生物工程公司；TRIzol試劑(貨號15596026)，美國Thermo公司；逆轉錄試劑盒(貨號RR037)、RNA擴增試劑盒(貨號RR420)，大連Takara公司；蛋白定量試劑盒(貨號PC0020、凝膠試劑盒(貨號P1200)，北京索萊寶科技有限公司；轉印膜(貨號IPVH00010)，美國Millipore公司；超敏化學發光液(貨號KE0101)，北京密碼子生物公司。

G6805型電針儀，蘇州醫療用品廠有限公司；0.30×25 mm型針灸針，蘇州醫衛材料公司；63031型Morris水迷宮、F6774型Y迷宮，深圳瑞沃德生命科技有限公司；SMART3.0型行為學視頻追蹤軟件，美國Harvard Apparatus公司；Minilys型組織研磨儀，法國BT公司；1510型酶標儀、ES-A01-NanoDrop 2000/2000c型紫外分光光度計，美國Thermo公司；ABI7500型實時熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；GL-150型恒溫加熱儀，海門其林貝爾儀器制造有限公司；HM325型石蠟切片機，美國Thermo公司；BX53型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；VE-180型垂直電泳槽、VE-186型轉移電泳槽，上海天能科技有限公司；Universal Hood Ⅲ型蛋白印跡檢測系統，美國Bio-Rad公司。

1.3 分組與模型制備

將27只2月齡雄性Sprague Dawley大鼠按照隨機分配原則分為對照組、模型組和電針組每組各9只，采用改良多平臺水環境法誘導建立SD大鼠模型[14]。此方法是指大鼠進入快速眼動睡眠時肌張力下降，可落入水中。由于大鼠恐水，落水后會盡全力爬上平臺，所以可達到睡眠剝奪。設備包括一個110 cm × 60 cm ×40 cm鼠箱，內置15個直徑6 cm、高8 cm的圓形平臺，平臺間隔15 cm。每天實驗開始前，向箱內注清水至平臺下約1 cm處，水溫(23±2)℃。實驗開始前3 d，每天把大鼠放于平臺上適應2 h。實驗時讓大鼠每天在平臺上停留20 h(前一天下午2∶00—第二天上午10∶00)[15，16]持續7 d。大鼠可在平臺間穿梭和停留，并可自由攝食和飲水。對照組大鼠在直徑18 cm的大平臺水環境中飼養(由于平臺大，大鼠通常不會落入水中)，其余條件同改良多平臺水環境法。

1.4 干預方法

本研究中選穴定位依據中國中醫藥出版社出版、郭義主編的《實驗針灸學》(新世紀第四版)。百會位于頂骨中點，大椎屬督脈，位于第七頸椎棘突與第一胸椎棘突之間。電針組治療于每天同一時間進行，選用直徑0.30 mm、長25 mm的毫針，直刺或斜刺進針后針柄連接電針儀輸出端，刺激參數選用連續波、頻率2Hz、電流1 mA，刺激強度以大鼠四肢輕微抖動為度，每次15 min，每日1次，連續7 d。對照組使用大平臺水環境，模型組使用改良多平臺水環境法造模，電針非穴位即在百會和大椎穴旁4 mm處，連接電針儀但不通電。

1.5 檢測指標和取材

1.5.1 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮是通過強迫大鼠游泳，讓其學習尋找隱藏在水中的平臺。本研究用于評價電針對大鼠海馬依賴性空間學習記憶能力的影響。該系統由圓形水池、自動錄像記錄系統及分析軟件三部分組成。圓形水池的直徑和高分別為120 cm和50 cm，水池分4個象限，其中一象限中放置一直徑和高分別為12 cm和32 cm的平臺。實驗第2天開始水迷宮測試，每天在固定時間進行。測試前向水池注入清水，水面高于平臺1 cm，溫度(23±2)℃，并加入奶粉攪拌至平臺不可見。采用SMART 3.0行為學視頻追蹤軟件記錄大鼠逃避潛伏期。

第1天到第5天進行定位航行實驗，用于檢測大鼠空間學習能力。實驗開始前把大鼠放入水中熟悉環境5 min，實驗時將大鼠分別從4個象限面向池壁放入水中，記錄其找到平臺的時間即逃避潛伏期。若能找到平臺，讓大鼠在平臺停留15 s。若未能在1 min內找到平臺，則將其引導至平臺并停留15 s，逃避潛伏期記為60 s。平臺在定位航行實驗結束后移走。

第6天進行的空間探索實驗用于檢測大鼠空間記憶能力。將大鼠于原平臺所在象限的對面象限面向池壁放入水中，記錄分析大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比。

1.5.2 Y迷宮測試 Y迷宮用于評價每組大鼠工作記憶能力。Y迷宮由三個長度相等的臂組成，相鄰臂之間的夾角為120°。將動物放在Y迷宮中心，讓其在安靜環境下探索5 min。大鼠連續進入3個不同的臂即為1次準確交替，自發交替準確率=[準確交替次數/(進臂總次數-2)]/100%，使用SMART 3.0軟件記錄和分析數據。

1.5.3 組織取材 行為學測試結束后，分別用20%(質量/體積)烏拉坦進行腹腔注射麻醉，每組6只大鼠冰上快速取腦，用眼科鑷分離兩側海馬組織。分別置于離心管中凍存-80 ℃，用于實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測。

另外每組剩余3只大鼠麻醉后打開胸腔，暴露心臟及右心耳。沿心尖注入預冷生理鹽水，并迅速剪開右心耳進行灌注。肝臟顏色逐漸蒼白，更換預冷4%多聚甲醛，由快到慢直至大鼠四肢抖動僵直、尾巴翹起即停止灌注。斷頭取全腦，將腦組織放入固定液中，常溫下4%多聚甲醛固定24 min，用于免疫組織化學法檢測。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt 的mRNA表達 冰凍海馬組織加入1 mL總RNA抽提試劑TRIzol研磨，低溫離心取上清并提取RNA，采用紫外分光光度計測量總RNA濃度，接著進行逆轉錄。表1示，引物設計均由上海生工合成。按照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環，72 ℃延伸10 min。每個樣品均做3個平行孔，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法分別計算Beclin1、LC3B、PI3K和Akt的mRNA相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5.5 免疫組化法檢測大鼠海馬Beclin1和LC3B的表達 將組織從固定液中取出，依次進行梯度酒精脫水，將浸好蠟的組織進行包埋，修整包埋后的蠟塊并切片厚度4 μm，切片放入二甲苯和酒精中脫蠟至水。用3%過氧化氫封閉以滅活內源性過氧化物酶。然后將組織切片置于修復盒中，微波爐進行抗原修復。切片上滴加配好的一抗Beclin 1(1∶200)和 LC3B (1∶200)，濕盒內4℃過夜。清洗后加入二抗(1∶400)，室溫孵育1 h。顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度。

1.5.6 免疫印跡法檢測大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達 取冰凍海馬組織加入裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑中，研磨至裂解液中無明顯塊狀組織。4℃離心10 min收集上清液檢測濃度，并將蛋白100℃電加熱5 min使其完全變性。每個泳道分別取20 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。取出凝膠，與PVDF膜和濾紙進行轉膜。

轉膜后使用脫脂奶粉封閉1 min，清洗后加入使用5%脫脂奶配制的一抗PI3K(1∶1000)、Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)和β-actin(1∶2000)，4℃下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 min。加ECL超敏化學發光液進行曝光成像，使用Image J軟件和β-actin作為內參分析比較。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 電針對SD大鼠空間學習記憶能力的影響

在定位航行實驗的第5天，與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)；電針治療可使SD模型大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)。空間探索實驗結果表明，與對照組比較，模型組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比下降(P<0.05)；電針治療可使SD模型大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比上升(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較

2.2 電針對SD大鼠工作記憶能力的影響

各組大鼠總進臂次數無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，模型組大鼠自發交替準確率明顯降低(P<0.05)，電針治療可使SD大鼠自發交替準確率增加(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠Y迷宮實驗結果比較

2.3 電針對各組大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中Beclin1和LC3B的mRNA表達水平升高(P<0.05)，PI3K mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠海馬組織中Beclin1和PI3K的mRNA表達分別下降和增加(P<0.05)，而LC3B mRNA水平有下降趨勢(P>0.05)。另外，各組間Akt mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt mRNA表達比較

2.4 電針對各組大鼠海馬CA1區Beclin1和LC3B蛋白表達的影響

自噬主要相關蛋白Beclin-1和LC3B主要位于海馬CA1區神經元細胞質中，陽性表達呈現深黃色或褐色(圖中紅色箭頭所指)。免疫組化結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區神經元胞質著色呈現深黃色或褐色，有大量陽性細胞；電針治療可使SD大鼠海馬CA1區神經元胞質中的Beclin-1平均光密度減少(P<0. 05)，而 LC3B平均光密度有減少的趨勢(P>0. 05)，這與Beclin1和LC3B的mRNA結果基本一致(見表5圖1)。

表5 各組大鼠海馬CA1區Beclin1、LC3B平均光密度比較

圖1 各組大鼠海馬CA1區Beclin1和LC3B蛋白表達比較(50 μm)

2.5 電針對大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬組織內PI3K和p-Akt /Akt表達水平降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠海馬組織PI3K和p-Akt /Akt水平增加(P<0.05)(見表6圖2)。

表6 各組大鼠海馬PI3K、p-Akt/Akt比較

圖2 各組大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達

3 討論

SD屬于中醫學失眠和不寐等范疇[17]，其引起的學習記憶障礙屬于中醫學善忘和呆癥等范疇。百會屬督脈，督脈是諸陽經之匯，對整個經脈系統有統帥作用。百會穴可振奮陽氣、安神定志和醒腦開竅[18，19]。大椎穴又名百勞穴，匯聚手足三陽的陽熱之氣與督脈的陽氣上行頭頸[20]。本研究選用電針百會和大椎穴干預SD模型大鼠，觀察到電針百會和大椎穴可增強改良多平臺水環境法誘導建立的SD大鼠模型學習記憶能力，而且這種改善作用可能與激活PI3K/Akt信號通路，降低自噬相關基因Beclin-1表達水平相關。

Morris水迷宮和Y迷宮是檢測學習記憶的重要行為學方法[21，22]。結果顯示，電針治療可縮短SD模型大鼠在Morris水迷宮中的逃避潛伏期，增加穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比，提高Y迷宮中自發交替準確率，這說明電針百會和大椎穴可改善改良多平臺水環境法誘導建立的SD模型大鼠的學習記憶能力。

Beclin-1和LC3是自噬的關鍵標志物，常用于評價自噬水平，其中Beclin1主要募集蛋白質與PI3K形成復合物，并引導其他自噬相關蛋白定位于自噬體膜，促進自噬體膜的形成[23]。而LC3位于自噬體表面，是自噬體的關鍵標志物[24]。LC3包括A、B和C 3個亞基，常通過檢測LC3B來衡量LC3的表達。SD病理改變與細胞過度自噬密切相關。SD相關的學習記憶能力被認為是海馬依賴性的。因此，研究假設電針增強改良多平臺水環境法誘導建立的SD大鼠模型學習記憶能力與降低海馬神經元自噬水平相關。為驗證這一假設，分別采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測海馬Beclin-1與LC3B的mRNA和蛋白表達。結果顯示，電針治療可降低海馬Beclin-1的mRNA和蛋白水平，同時有下調LC3B mRNA和蛋白表達的趨勢，提示電針改善SD大鼠學習記憶可能與降低海馬神經元自噬水平相關。

已有研究發現，PI3K/Akt信號通路參與調節神經元自噬，其活性下降可導致SD細胞自噬過度和細胞凋亡[10，11]。激活PI3K/Akt信號通路能夠防止SD中神經元凋亡和丟失，具有神經保護作用[25，26]。為進一步探討PI3K/Akt信號通路在電針改善SD模型大鼠認知障礙，降低海馬神經元自噬水平中的作用，本研究又通過實時熒光定量PCR和免疫印跡法，分別檢測PI3K和Akt的mRNA和蛋白表達。結果表明，與對照組比較，改良多平臺水環境法誘導能夠降低SD大鼠海馬PI3K和Akt的mRNA與蛋白水平，說明SD中PI3K/Akt通路活性降低，這與文獻結果一致[27，28]。另外，Akt有2個主要的磷酸化位點Thr308和Ser473，激活Akt主要依賴于Ser473的磷酸化[29]。本研究中，磷酸化位點為Ser473的p-Akt在SD大鼠海馬表達降低，而電針逆轉了這種降低；然而，Akt的表達沒有明顯改變，表明Akt是通過磷酸化發揮作用的。本研究觀察到，電針可使SD大鼠模型海馬中的PI3K mRNA和蛋白表達以及p-Akt/Akt水平上升，這些提示電針可增加PI3K/Akt信號通路活性，降低神經元自噬，進而改善SD相關的認知障礙。

睡眠是由2個交替出現的不同時相組成，即快速眼動睡眠和非快速眼動睡眠，這2種睡眠時相的數量決定了睡眠的質量[30]。失眠模型大鼠的非快速眼動睡眠和快速眼動睡眠的數量均減少，覺醒時間延長，而且非快速眼動睡眠轉換為快速眼動睡眠的次數減少[31]。電針治療對SD大鼠各睡眠時相的影響如何，電針治療在改善SD大鼠認知障礙的同時是否能增加各睡眠時相的數量和轉換次數，這些內容需在后續的研究中探討。

綜上所述，電針百會和大椎穴改善多平臺水環境誘導建立的SD模型大鼠的學習記憶能力，可能與電針通過增強PI3K/Akt信號通路活性、減輕海馬神經元自噬相關，這些結果為電針應用于臨床治療睡眠剝奪奠定了理論與實驗基礎。