基于網絡藥理學和分子對接探究益腎達絡飲治療多發性硬化的作用機制?

任嘉彥， 丁文婧， 王忠敏， 何靜文， 尚曉玲

(長春中醫藥大學， 長春 130117)

多發性硬化癥(multiple sclerosis, MS)是中樞神經系統的一種炎性脫髓鞘疾病[1，2]，以神經功能的缺損進而導致殘疾為特征[3]。目前認為，該病的發病機制與星形膠質細胞、T細胞自身免疫反應等關系密切[4，5]。急性期多采用短療程大劑量糖皮質激素沖擊療法，如甲基強的松龍沖擊治療、潑尼松口服等，減輕急性發作癥狀。緩解期以疾病修正治療藥物如特立氟胺、重組人干擾素β-1b控制疾病進展，預防復發。

益腎達絡飲由古方地黃飲子化裁而來，由熟地黃、當歸、梔子、豨薟草、石菖蒲、粉萆薢、甘草、鹿角膠7味中藥構成。前期實驗證明，益腎達絡飲可通過多條信號通路改善多發性硬化的癥狀，如抑制細胞外調節激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2, ERK1/2)通路[6]的激活，抑制酪氨酸激酶(janus kinase, JAK)-信號轉導子和轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信號傳導通路[6]，調節輔助性T細胞1/2(T helper cell 1/T helper cell 1, Th1/Th2)平衡[7]，降低炎癥因子白細胞介素(interleukin, IL)2、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)α、趨化因子-12(CXC chem okine ligand-12, CXCL12)[8]、趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1, MCP-1)[9]的釋放等。還通過促進神經元的發育、再生及突觸形成發揮治療作用，如升高環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的磷酸化水平[10]等。本研究應用網絡藥理學方法，對益腎達絡飲的主要活性成分、作用靶點及信號通路進行分析，并經初步實驗驗證，揭示了本復方治療多發性硬化的作用機制，為進一步的臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料庫

表1示，本文所涉及的資料庫。

1.2 益腎達絡飲活性成分和靶點預測篩選

活性成分查于TCMSP[11]，設置Oralbiovavail-ability(OB)≥0.3，drug-likeness(DL)≥0.18，再用Uniport庫[12]檢索靶點的基因名。

1.3 多發性硬化疾病靶點的篩選

通過GeneCards[13]、OMIM[14]、PharmGkb[15]、TTD[16]、Drugbank[17]數據庫，“Mutiple Sclerosis”為關鍵詞，獲得疾病靶點合并去重。

1.4 益腎達絡飲和多發性硬化的共同靶點篩選

采用Cytoscape 3.8.0軟件，將1.2取交集，“VennDiagram”制作韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點(潛在靶點)。

1.5 調控網絡構建

根據1.4得到的交集靶點，使用cytoscape3.8.0軟件中的Network功能進行可視化調控網絡分析，度值(Degree)與節點呈正比，得到調控網絡圖，并篩選出該網絡中重要的活性成分。

1.6 蛋白互作網絡構建

將1.4的交集靶點輸STRING庫[18](minimum required interaction score>0.9)，構建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)[19]，再導入Cytoscape3.8.0，CytoNCA對節點分析，連接靶點多的節點為關鍵靶點，介度(Betweeness)、緊密度(Closeness)、節點連接度(Degree)、特征向量(Eigenvector)、局部平均連通度(LAC)、網絡(Network)均大于中位值過濾。

1.7 GO、KEGG分析

通過R(4.0.4版本)軟件GO分析[20]，將藥物-疾病交集基因以P<0.5、Benjamini<0.5為參數進行富集顯示。KEGG[21]通路富集以交集基因P<0.5、FDR<0.05為參數。

1.8 分子對接驗證

PubChem[22]下載小分子配體2 D結構，通過ChemBio3D Ultra(14.0.0.117)將2 D結構轉換為3D并進行優化；PDB庫[23]下載3 D受體，PyMOL刪除水和小分子配體；借助Auto Dock Tools將配體加氫，確定活性口袋。Vina軟件完成結合位置確定，并計算自由能，再利用PyMol軟件繪制最優對接結果圖。

1.9 動物及主要試劑

1.9.1 動物 SPF級C57BL/6雌雄鼠，購自遼寧長生公司，實驗動物許可證號SCXK(吉)2020-0001。飼養、繁殖于長春中醫藥大學動物實驗中心，用以繁殖乳鼠。

1.9.2 含藥血清 將C57BL/6雌鼠隨機分5組，空白組20只，中藥高中低劑量、激素組各10只。高、中、低3組小鼠分別以4 g/(kg·d)、2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)劑量的益腎達絡飲藥液進行灌胃，激素組用醋酸潑尼松龍片懸濁液0.2 mL/次[0.078 mg/(kg·d)，空白組等量0.9%氯化鈉溶液]，灌胃7 d眼球取血，3900 r/min離心10 min取血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存。

1.9.3 主要試劑 0.25%胰酶(Gibico公司，25200072)；DMEM/F12培養基(Hyclone公司，SH30023.01B)；4%多聚甲醛(上海源葉公司，R20497)；細胞增殖及毒性檢測試劑盒CCK-8(bioss公司，BA00208)；DAPI染色液(C02-04002)、曲拉通X-100(C03-03002)、抗熒光淬滅封片液/抗熒光衰減封片劑(C02-04003)、FITC抗體標記試劑盒(bioss公司，bs-0295G)；脂多糖(L2880-10 mg，Sigma公司)；TNF-α、IL-1βELISA盒(睿信生物CK202112M,CK203063M)；中藥飲片益腎達絡飲購自吉林同仁大藥房(長春迅馳廣場店)。

1.10 星形膠質細胞的分離、原代培養及鑒定

原代提取星形膠質細胞(astrocytes, AST)是參照參考文獻[14]中使用的方案，經純化、傳代后，采用膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫熒光鑒定星形膠質細胞純度。

1.11 益腎達絡飲含藥血清對LPS誘導的星形膠質細胞活力的影響

96孔板中，細胞以9×103個/孔接種，5組3復孔分別加入的試劑為空白組10%空白血清，模型組10%空白血清，益腎達絡飲高劑量組、益腎達絡飲中劑量組、益腎達絡飲低劑量組和醋酸潑尼松龍對照組分別加入對應10%含藥血清，作用12 h后，除空白組其他各組再加入1 μg/mL LPS作用24 h，加CCK-8液10 μL/孔2 h，450 nm檢測吸光度(OD)值。細胞活性=(OD對照組 -OD對照空白孔)/(OD空白組 -OD空白孔)×100%。

1.12 對炎癥因子TNF-α、IL-1β水平的影響

按照1.11分組和處理收集上清，按照試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-1β水平。

1.13 統計學方法

2 結果

2.1 益腎達絡飲活性成分和靶點預測篩選

經TCMSP庫篩選得到方劑中7味中藥的活性成分，分別為熟地黃2個，當歸2個，粉萆薢2個，石菖蒲4個，豨薟草7個，梔子15個，甘草92個，其中鹿角膠因無有效預測靶點被剔除，篩選出益腎達絡飲的124個活性成分，重合活性成分5個，分別為當歸、豨薟草、梔子共有的β-谷甾醇(beta-sitosterol)，當歸、熟地黃、豨薟草、梔子重合活性成分為豆甾醇(stigmasterol)，石菖蒲、梔子、甘草重合活性成分為山柰酚(kaempferol)，熟地黃、甘草重合活性成分為谷甾醇(sitosterol)，梔子、甘草重合活性成分為槲皮素(quercetin)，合并去重最終篩選出益腎達絡飲的115個活性成分，其主要活性成分對應的作用靶點225個(見表2)。

表2 益腎達絡飲主要活性成分基本信息比較

2.2 多發性硬化癥的靶點預測

圖1示，經檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、Drugbank數據庫合并得到關于多發性硬化的8098個疾病靶點。

圖1 多發性硬化疾病靶點圖

2.3 共同靶點篩選

圖2示，益腎達絡飲中的225個靶點與多發性硬化8098個靶點進行韋恩圖繪制，得到199個交集靶點，即為益腎達絡飲活性成分治療多發性硬化的潛在靶點。

注：Disease表示多發性硬化疾病，Drug表示益腎達絡飲方劑，兩圓共同部分顯示199個共同靶點圖2 益腎達絡飲和多發性硬化的共同靶點韋恩圖

2.4 調控網絡構建

圖3示，益腎達絡飲活性成分-多發性硬化疾病靶點調控網絡圖，分析得到309個節點1589個關系，中間部分黃色長方形代表199個靶點基因，外周圓圈表示活性成分，綠色表示甘草，藍色表示粉萆薢，橙色代表豨薟草，粉色代表石菖蒲，紫色圓圈代表梔子，靛青色代表熟地黃，紅色代表當歸，共有成分用多色表示，根據degree值大小排序，篩選出該網絡中節點最多的活性成分前10位。

圖3 益腎達絡飲活性成分治療多發性硬化的調控網絡圖

表3 益腎達絡飲重要活性成分的基本信息

2.5 蛋白互作網絡構建

圖4示，益腎達絡飲治療多發性硬化的PPI網絡，得到作用靶點198個，靶點與靶點之間的相互關系達779條。圖5示，經CytoNCA插件進一步查找網絡核心，該網絡的Betweenness中位值為62.4，Closeness的中位值為0.1，Degree的中位值為7，Eigenvector的中位值為 0.03，LAC的中位值為2.8，Network的中位值為3.7，篩選6個過濾條件均大于中位數的為關鍵靶點，用黃色方框表示，得到的基因共計51個，即51個節點338條邊。在此基礎上，再次按照6個過濾條件提取分析，得到各條件的中位值分別為Betweenness: 18.6，Closeness: 0.5，Degree: 11，Eigenvector: 0.1，LAC: 5.875，Network: 7.1，得到關鍵靶點17個176條邊，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、TNF、細胞腫瘤抗原p53(Tumor Protein P53, TP53)等。

圖4 益腎達絡飲-多發性硬化PPI網絡圖

圖5 益腎達絡飲-多發性硬化PPI核心網絡圖

2.6 GO富集分析

圖6示，GO富集分析以P<0.05為條件，得到富集結果2574個，其中生物過程2254個，細胞組成98個，分子功能222個，選擇前10個繪制，表明益腎達絡飲治療多發性硬化的生物過程主要與炎癥、氧化應激和化學激反應相關；細胞組成富集顯示，與類固醇激素受體、磷酸酶結合、細胞因子受體結合等方面相關。

注：顏色P值紅→藍遞增，橫坐標-數目，BP-生物過程、CC-細胞組成和MF-分子功能圖6 益腎達絡飲-多發性硬化GO富集分析圖

2.7 KEGG富集分析

圖7示，KEGG富集分析以P<0.5為條件，通路富集結果得到178條通路，主要與炎癥、細胞生長、分化、應激與凋亡反應、缺氧反應、免疫反應有關，涉及磷酸肌醇3激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway, PI3K/AKT)、MAPK、IL-17、TNF、腎素血管緊張素系統(renin angiotensin system, Ras)、環化腺核苷一磷酸(cyclized adenosine monophosphate, cAMP)等信號通路。在TNF信號通路中，有26個靶點參與，關鍵靶點為JUN、AKT、TNF。益腎達絡飲重要靶點TNF參與了包括MAPK、IL-17等60條通路，參與調節多發性硬化免疫細胞及炎癥反應及中樞神經髓鞘損傷等。圖8示，選擇其中重要的TNF通路繪制通路圖。

注：顏色P值紅→藍遞增，橫坐標-基因比例，圓圈大小-基因的數目圖7 益腎達絡飲-多發性硬化KEGG通路分析(排名前30)

2.8 分子對接驗證結果

將2.4得出益腎達絡飲重要活性成分，考慮中藥本身及復方治療多發性硬化作用，選取甘草、梔子的共有成分槲皮素(quercetin)，甘草、石菖蒲、梔子共有成分山柰酚(kaempferol)作為核心成分，即小分子配體。綜合2.5 PPI網絡以及GO和KEGG得到的關鍵靶點，根據多發性硬化疾病特點選取TNF-α作為核心靶點即受體，再通過分子對接進行初步驗證。通過結合能(affinity)評估對接結果，affinity越小表示分子對接結合效果越好。

注：圖中的矩形框為一種基因/蛋白質節點，紅色為益腎達絡飲關鍵作用靶蛋白圖8 KEGG通路TNF信號通路模式圖

2個小分子配體(MOL000098、MOL000422)與受體TNF進行模擬對接結果顯示，quercetin-TNF結合能為-4.8(kcal/mol)，kaempferol-TNF結合能為-4.1(kcal/mol)，表明quercetin、kaempferol與TNF均有較強的結合活性，初步驗證了網絡藥理學的挖掘結果。圖9、10示，借助PyMol軟件將對接結果進行可視化。

圖9 槲皮素(quercetin)與TNF對接

圖10 山柰酚(kaempferol)與TNF對接

2.9 星形膠質細胞的鑒定

原代培養的小鼠大腦皮質星形膠質細胞24 h后大多數星形膠質、神經元開始貼壁，約7 d后形態上星形膠質細胞呈聚集性生長，邊緣不易辦認，為多角形后逐漸開始鋪展，細胞體增大，部分細胞突起伸長呈梭形，偽足增多，細胞更加透明，膠質細胞基本滿瓶底，約10 d時細胞開始分層。圖11示，經純化和GFAP免疫熒光鑒定后，星形膠質細胞形態明顯，多呈梭形，GFAP表達主要位于胞漿和突起內，陽性細胞數為95%以上，可以用于接下來的實驗。

注：綠色-GFAP陽性；藍色-DAPI細胞核，星形膠質細胞純度=星形膠質細胞數/細胞總數×100%。N=3；Scale bar=100 μm圖11 星形膠質細胞鑒定

2.10 益腎達絡飲含藥血清對LPS誘導的星形膠質活性能力的影響

表4示，采用1 μg/mL LPS造成炎癥環境模型，測定細胞的活性能力。與空白組比較，模型組活性顯著升高；與模型組比較，益腎達絡飲高劑量組和醋酸潑尼松對照組增殖活性均顯著升高(P<0.01)，益腎達絡飲中、低劑量組細胞活性升高(P<0.05)。

表4 星形膠質細胞活性

2.11 益腎達絡飲對LPS誘導的星形膠質細胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的影響

圖12、13示，模型組與空白組比較(P<0.01)，TNF-α、IL-1β水平明顯升高；益腎達絡飲低、中、高劑量組與模型組比較(P<0.01)，均能顯著降低TNF-α、IL-1β水平，且益腎達絡飲高劑量組效果更為明顯，表明益腎達絡飲能夠降低LPS誘導的星形膠質細胞炎性反應。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖12 益腎達絡飲對星形膠質細胞TNF-α表達影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖13 益腎達絡飲對星形膠質細胞IL-1β表達影響

3 討論

MS好發于中青年，以女性較為多見，主要侵犯中樞神經系統的白質，具有病變部位廣泛、癥狀復雜多變的特點。目前急性期治療以沖擊糖皮質激素為主，控制緩解期復發是重點，不僅費用高且療效差。中醫認為多發性硬化與督脈和腦關系密切。本團隊在多年臨床經驗積累中，認為多發性硬化的病機為腎陽虛、虛生毒、毒入絡、絡病生。基于此，創立了中藥復方益腎達絡飲，方中熟地黃、鹿角膠、杜仲可益腎填精，梔子、石菖蒲解毒化濁，郁金、粉萆薢解郁通絡，充分體現中醫“補瀉兼施，調和陰陽”的思想[24]。

本研究篩選出益腎達絡飲中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等重要活性成分。已有研究表明，槲皮素有促進髓鞘再生、保護小鼠神經髓鞘損傷的作用[25]，通過抑制小膠質細胞衍生的氧化應激反應和炎癥反應，有效減輕小鼠的認知、運動功能缺陷，提示其對神經損傷有治療作用[26]。山柰酚是一種黃酮類化合物[27]，主要來源于蔬菜及水果[28]。山柰酚及其苷類可能對神經退行性疾病的治療有益[29]，其能抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和STAT3活化，從而減輕中樞神經系統炎癥[30]，β-谷甾醇可有效調節促/抗炎細胞因子[31]。益腎達絡飲治療多發性硬化的關鍵靶點MAPK、AKT、TNF、STAT3等17個。MAPK信號轉導通路家族成員中的ERK1/2、P38、SAPK/JNK等[32-34]，在多發性硬化中發揮重要作用。已有研究表明，過度激活的MAPK可導致小膠質細胞功能障礙，從而導致神經脫髓鞘[35]。原發性星形膠質細胞中Src/MAPK/PI3K/NF-κB通路與多發性硬化的關系密切[36]；在復發-緩解型多發性硬化癥患者的CD4+T和調節性T細胞(regulatory cells, Tregs)中，AKT表達水平被抑制[37]，STAT3基因表達增加[38]；TNF基因位點的變異引起多發性硬化患病率增高[39]，TNF-α、IL-17等炎癥因子可以啟動腦內免疫應答，直接或間接損害中樞神經系統的髓鞘，介導多發性硬化的發病。團隊前期工作也證明，本復方具有降低TNF-α[40]表達的作用。

GO、KEGG通路分析結果顯示，益腎達絡飲治療多發性硬化的生物學進程主要集中在炎癥反應、氧化應激反應等。炎癥反應和氧化應激關系緊密，兩者在惡性循環中相互關聯，氧化應激和抗氧化能力的生物標志物可以作為評估多發性硬化患者炎癥狀態的潛在工具。PI3K/AKT信號通路可促進軸突再生[41]和軸突髓鞘形成[42]，PI3K/AKT/Fox01通路可抑制IL-17和轉錄因子孤核受體(orphan nuclear receptor, RORγt)的表達，達到治療多發性硬化的目的。

分子對接結果可知，益腎達絡飲進入機體后能與相關受體有較好的親和力，同時也進一步證明本文中預測益腎達絡飲成分與多發性硬化靶點的可靠性。

星形膠質細胞在多發性硬化變化發展中有著雙向作用，既有積極性作用，分泌有利于中樞神經恢復的因子促進神經生長和修復等，又有抑制性作用，增加分泌IL-1β、IL-6，TNF等致炎因子和趨化因子，這些物質對神經細胞具有毒性作用[43，44]。在致炎因素作用下，星形膠質被活化成反應性星形膠質，細胞肥大、增殖異常等[45，46]，反應性星形膠質細胞可誘導Th0向Th1或Th17轉化，而Th1或Th17又可分泌一系列炎癥因子，引發正反饋式的炎癥級聯反應[47]，啟動腦內免疫應答。已有研究表明，LPS可誘導星形膠質細胞活化[48]，模擬中樞炎癥反應。體外實驗中，益腎達絡飲的高、中、低劑量組均對LPS誘導的星形膠質細胞炎性損傷起到一定的保護作用，可降低TNF-α、IL-1β的分泌(P<0.01)，說明益腎達絡飲可能通過發揮抗炎作用而達到治療多發性硬化的目的，且在分子對接中TNF-α與益腎達絡飲重要活性成分(MOL000098槲皮素，MOL000422山柰酚)有較好的親和力。

綜上所述，本研究篩選出益腎達絡飲通過MAPK、AKT、TNF等關鍵靶點參與PI3K-AKT、MAPK、IL-17、TNF-α等多條通路發揮抗炎、調節免疫應答和促進軸突再生和髓鞘形成作用。進一步證明，益腎達絡飲的活性成分可通過多種生物學變化影響多發性硬化的發生發展。并從體外實驗驗證，該方劑對多發性硬化潛在靶點的影響，為該方劑治療本病提供了機制研究思路。