熒光成像技術(shù)用于獨活根中香豆素類成分積累規(guī)律研究

姬黨通 陳玉瑩 李 欠

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州，730070； 2 省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，蘭州，730070)

獨活是傘形科植物重齒毛當歸的干燥根[1]，作為一種傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的歷史，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記錄。獨活性溫和，味辛辣、苦澀，由于其有效的藥用價值，已被列入《中華人民共和國藥典》和《歐洲藥典》等藥典中。具有祛風除濕、散寒止痛的功效，通常主要進入腎經(jīng)和膀胱經(jīng)來發(fā)揮治療作用[2-3]。此外，獨活還用于保健領(lǐng)域和美容化妝領(lǐng)域。

獨活中化學成分復(fù)雜。迄今為止，已從獨活中分離鑒定出87種化合物，包括香豆素、多烯炔烴、酚酸和甾體等。此外，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了近100種揮發(fā)油化合物。相關(guān)研究報道，香豆素是獨活中含量最豐富的化合物，并且是獨活中最主要的生物活性成分[4-6]。香豆素類物質(zhì)最初被用作香料，但在后期的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物具有抗炎、抗氧化、抗菌以及鎮(zhèn)痛等活性作用。其中蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯和異歐前胡素已被作為獨活質(zhì)量控制的指標性成分。

藥用植物有效成分的積累和形成與其組織器官和部位有著密切的關(guān)系。組織化學是在形態(tài)學的基礎(chǔ)上來研究組織和細胞中的化學組成、分布規(guī)律與相對含量變化[7]，利用理化反應(yīng)來顯示植物組織切片中的某種化學成分。組織化學的發(fā)展在藥用植物有效成分的產(chǎn)生、分布規(guī)律及動態(tài)變化研究方面具有重要的作用，如對香豆素、揮發(fā)油、黃酮以及生物堿等的研究[8-11]。植物組織制片是組織化學研究中重要的環(huán)節(jié)，制片效果的好壞直接影響組織化學成分定位的準確性，植物組織制片過程常用的技術(shù)手段主要有半薄切片、石蠟切片、冰凍切片等。其中冰凍切片技術(shù)是在低溫條件下將生物組織進行速凍以達到一定硬度并進行切片的一種技術(shù)，與其他常規(guī)的切片方法相比，具有簡便、快速、易操作、對樣品破壞小等優(yōu)點[12-14]。本研究通過優(yōu)化獨活冰凍切片條件，得出藥材獨活的最佳制片方法。

熒光成像技術(shù)是指以特定波長的入射光激發(fā)照射物質(zhì)，通過計算機熒光成像系統(tǒng)獲取熒光圖像數(shù)據(jù)[15]，熒光成像技術(shù)可以不經(jīng)過染色處理，就能直接地觀察植物組織中自發(fā)熒光性成分[16-17]，同時利用熒光強度對植物組織中的有效成分含量進行相對定量分析。有研究者用激光掃描共焦顯微鏡術(shù)(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)研究了不同生長年限、不同部位球花石斛中香豆素類成分的含量及分布特征[18-19]。蘭志瓊等[20-21]對白芷中香豆素類成分進行組織化學定位研究，確定了香豆素的分布部位。辛華和丁雨龍[22]利用冷凍切片技術(shù)和常規(guī)石蠟制片技術(shù)，采用熒光顯微技術(shù)對珊瑚菜的根、葉片、葉柄等部位中的香豆素進行了組織化學定位。目前，中藥活性成分組織化學研究大多集中在糖類、脂類、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、分泌物等方面，但在藥材活性成分的定性與定量研究方面較少。藥用植物中有效成分多且復(fù)雜，活性成分作為藥材中的指標性成分，其產(chǎn)生、分布規(guī)律及含量的多少對藥材質(zhì)量品質(zhì)的評價具有重要意義。因此，本研究運用組織化學的設(shè)計思路，采用熒光成像技術(shù)對不同生長時期獨活根中的香豆素類成分進行定位、定量分析，以此建立獨活根中香豆素成分組織化學定位分析方法，為研究獨活活性成分的產(chǎn)生、分布、積累規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，為拓寬中藥的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 電熱恒溫真空干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號：DZF-1B)，冷凍切片機(Leica公司，德國，型號：CM1950)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國，型號：LSCM 800)，正倒置一體熒光顯微鏡(ECHO公司，美國，型號：BX61+DP70，RVL100-G)；丙三醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20201116)，最優(yōu)切削溫度(Optimal Cutting Temperature Compound，OCT)包埋劑(Leica公司，德國，批號：14020108926)；獨活新鮮根取自甘肅省華亭市(165°65′E，35°22′N)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學中草藥栽培與鑒定系陳垣教授鑒定并確認為傘形科植物獨活，試驗取材以不同生長期(4、6、8、10、12月)的獨活中部新鮮根作為材料。

1.2 獨活根冰凍切片的制作

1.2.1 不同保護劑的考察 植物組織冰凍切片過程中，保護劑的使用對植物組織中活性成分的穩(wěn)定性以及切片的完整性具有重要的作用。目前常用的冷凍切片保護劑有甘油和蔗糖等，保護劑可以和植物組織中的自由水結(jié)合，可以降低冰晶對細胞的損傷[23]。同時，部分凝固點較低的固定液也可以起到保護植物組織的作用。實驗對不同濃度的甘油和蔗糖溶液作為不同的保護劑進行考察，以篩選出獨活根最佳切片條件。見表1。

表1 不同濃度保護劑對獨活根冰凍切片質(zhì)量的影響

1.2.2 不同切片厚度的考察 藥材切片厚度直接影響切片質(zhì)量、切片的難易程度以及觀察的清晰度，所以在切片厚度的設(shè)置上綜合考慮了以上3種因素。通常越薄切片質(zhì)量越好，但植物組織破碎程度嚴重，切片過厚影響熒光顯微觀察的透明度及清晰度。為此，分別對以下3個等級厚度切片進行試驗考察。見表2。

表2 不同切片厚度對獨活根冰凍切片質(zhì)量的影響

1.3 香豆素類成分自發(fā)熒光組織化學定位研究

1.3.1 香豆素對照試驗 取蛇床子素作為對照，配制成10 mg/mL的蛇床子素標準品溶液，置于載玻片上，滴加15%甘油進行封片，制成臨時對照品。依據(jù)香豆素成分易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑的性質(zhì)，將切片組織依次通過70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中分別處理30 min，以去除組織中的香豆素類成分。

1.3.2 香豆素自發(fā)熒光顯微成像定位觀察 以優(yōu)化的最佳切片條件切片后將樣品置于熒光顯微鏡下進行觀察，根據(jù)香豆素化合物可在最佳激發(fā)波長的激光下發(fā)出藍色自發(fā)熒光的特性，可在353 nm激發(fā)下，發(fā)射出熒光的特性，觀察獨活根中香豆素的自發(fā)熒光并拍照。

1.3.3 運用激光掃描共聚焦熒光顯微成像技術(shù)對不同時期獨活中的香豆素類成分進行相對定量分析 試驗以采收期的新鮮獨活為材料進行預(yù)實驗，以此篩選得到最佳制片條件。試驗選取4、6、8、10、12月等5個不同生長時期的新鮮獨活藥材作為材料，每個時期隨機選取10株，以篩選出的最佳冰凍切片條件分別制備不同時期獨活根的組織切片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡在4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino2-phenylindole，DAPI)通道下進行熒光成像觀察并拍照，每株藥材分別獲取10個不同視野下的熒光圖像，并記錄熒光算術(shù)平均強度，做統(tǒng)計學分析處理。

1.4 獨活根分泌組織測量統(tǒng)計 運用正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察組織結(jié)構(gòu)，在相應(yīng)視野倍數(shù)下，利用顯微測量技術(shù)對不同樣品、不同部位處隨機選取10個視野統(tǒng)計其分泌組織的個數(shù)，并計算其單位面積的密度。此外，結(jié)合熒光成像對香豆素類成分集中分布部位的熒光強度進行測算。

熒光強度(FI)=分泌腔密度(個/mm2)×S韌皮部×FI總強度

2 結(jié)果

2.1 獨活根冰凍切片最佳切片結(jié)果

2.1.1 保護劑的選擇 研究發(fā)現(xiàn)不同種類、不同濃度梯度的保護劑對于獨活根冰凍切片的完整性至關(guān)重要。同濃度的甘油和蔗糖溶液，濃度大于15%時，隨著保護劑濃度的增大，獨活根組織難以達到切片的硬度，導(dǎo)致切片困難。濃度小于15%時，隨著保護劑濃度的減小，組織切片破碎嚴重，影響對組織的熒光顯微觀察。因此，選擇以15%甘油作為保護劑處理樣品時，得到的切片效果最佳。見圖1。

2.1.2 切片厚度的選擇 3個等級切片厚度研究發(fā)現(xiàn)，當切片厚度大于25 μm時，隨切片厚度的增加，雖然組織切片的破碎程度減小，但組織觀察透光率減小。當切片厚度≤20 μm，隨切片厚度的逐漸減小，切片組織細胞容易破碎，切片難度大。因此，試驗選擇切片厚度25 μm時，切片效果最佳。見圖1。

圖1 不同處理方法的獨活冰凍切片顯微圖(×100)

2.2 獨活中香豆素成分的分布特征 獨活組織切片通過激光掃描共聚焦顯微鏡，在DAPI通道下可自發(fā)產(chǎn)生藍色熒光。木栓層、栓內(nèi)層分泌腔、韌皮部分泌道及木質(zhì)部激發(fā)出藍色熒光，與陽性對照中蛇床子素對照品發(fā)出的熒光一致。切片經(jīng)過乙醇對照組處理后，分泌腔的藍色熒光消失，木栓層藍色熒光減弱，而木質(zhì)部仍有藍色熒光。表明香豆素成分主要分布在分泌腔、分泌道等分泌組織中。見圖2。

圖2 獨活根顯微結(jié)構(gòu)熒光成像圖(×100)

2.3 不同時期獨活中香豆素成分的熒光成像測定結(jié)果 試驗選取的5個時期獨活香豆素成分的熒光強度測量值如表3所示，利用Sigmaplot 14.0作圖軟件對不同時期獨活總香豆素含量動態(tài)趨勢變化進行分析。由圖3可知，獨活根中香豆素類成分總體變化趨勢呈“S”形增長模式，不同生長時期對獨活香豆素含量變化具有顯著影響。在4—10月生長期時段內(nèi)，隨生長期的延后獨活根中香豆素含量呈上升趨勢，10月香豆素含量達到最大值，熒光強度達1 952.580 6像素熒光強度。4—6月生長期的香豆素含量增幅緩慢，獨活營養(yǎng)生長前期地上部分處于快速增長階段，消耗大量的能量，藥材營養(yǎng)物質(zhì)積累較慢。進入8—10月后香豆素含量增幅較大，獨活地上部分生長趨于緩慢、莖葉趨于枯萎，利于根中營養(yǎng)物質(zhì)的積累。11月之后香豆素含量變化呈下降趨勢，獨活地上部分的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化結(jié)束，根系為了維持生命代謝，消耗了部分干物質(zhì)，根部干物質(zhì)損耗，不利于獨活藥材品質(zhì)的提高。

圖3 不同時期獨活總香豆素含量變化趨勢圖

表3 不同時期獨活香豆素成分的熒光強度值

2.4 獨活根分泌組織系數(shù)分析 獨活根的不同部位分泌組織及單位密度的顯微測量結(jié)果如表4～5所示。通過公式計算得韌皮部分泌腔部位香豆素類成分的相對熒光強度為2 443 701.637 1像素熒光強度。

表4 獨活根分泌組織測量結(jié)果

表5 獨活根不同組織部位測量結(jié)果(mm)

3 討論

本研究利用冰凍切片和熒光成像技術(shù)對不同時期獨活根中的香豆素成分進行定位定量分析研究，首次建立了獨活根冰凍切片及熒光成像新方法，通過對保護劑、切片厚度等不同切片條件的篩選，得出藥用植物獨活根組織制片最佳條件。即獨活根經(jīng)過15%甘油保護劑的處理，切片厚度為25 μm時切片效果最佳。這與川白芷、石斛等藥用植物的冰凍切片研究結(jié)果具有相同之處，不同之處在于其他研究沒有按植物不同時期進行開展試驗[24-25]。此外，研究利用顯微成像測量技術(shù)對不同部位分泌組織進行了統(tǒng)計分析，結(jié)合熒光成像對香豆素成分集中分布部位的熒光強度進行測算，發(fā)現(xiàn)香豆素類成分主要分布在分泌腔和分泌道中，韌皮部分泌腔部位香豆素類成分的熒光強度為2 443 701.637 1像素熒光強度。本研究建立的方法可在獨活組織不經(jīng)破壞處理的條件下，能簡捷、快速地對藥用植物中的自發(fā)熒光性成分進行原位分析及相對定量研究。

不同時期獨活根中香豆素類成分含量變化趨勢明顯，活性成分積累存在明顯差異。本研究同時兼顧組織化學結(jié)構(gòu)和有效成分含量，通過組織切片及熒光成像技術(shù)對不同時期獨活根中的香豆素類成分進行了定位、定量分析，建立的獨活香豆素類成分組織化學定位分析方法，可為研究其他植物中活性成分的產(chǎn)生、分布、積累規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，為拓寬中藥的研究提供一定參考。