脾虛肝亢證抽動障礙動物模型制備研究與應用現狀

史文麗 陳慧敏 馬丙祥

(1 河南中醫藥大學，鄭州，450000； 2 河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州，450000)

抽動障礙(Tic Disorder，TD)是一種復雜的兒童常見的神經發育障礙性疾病[1-2]，臨床表現為突然、快速、反復、非節律性的運動或發聲[3-4]，屬于中醫學“肝風證”“慢驚風”“抽搐”“筋惕肉瞤”等范疇，90%可伴注意力缺陷多動障礙、強迫障礙、自閉、焦慮、品行障礙、人格障礙及睡眠障礙等共患病[5-6]。目前全球發病率逐步上升[7]，國內發病率為1%～4%，全球發病率約3%，對學習、生活、社交均造成危害[8-10]。

動物模型是挑戰和驗證病理生理學假說的重要工具，并且在驗證新的治療方案中扮演重要角色。目前，國內醫學界對TD及其動物模型的認知程度非常有限，尤其是基于病證結合的動物模型。中醫臨床強調的是整體觀和辨證觀，最新的中藥新藥臨床試驗設計與評價技術指南將本病分為肝亢風動、痰火擾神、氣郁化火、脾虛痰聚、脾虛肝亢、陰虛風動6個證候，其中脾虛肝亢證最常見。因此，進行更精確的脾虛肝亢證TD動物模型相關研究有利于病因、病機探索及加速新藥研發進程。

1 脾虛肝亢證淵源

宋代閆孝忠(一說閆季忠)所著《小兒藥證直訣》卷上五臟所主有云：“心主驚，肝主風，脾主困，肺主喘，腎主虛。”[11]雖然強調了五臟分證，但同時需要重視五臟之間的相互影響[12-14]，故臨床采用“五臟證治理論”辨證治療TD[15-16]。由于小兒“肝常有余、脾常不足”體質特點，故脾虛肝亢證最為多見。小兒脾常不足，飲食失節，恣嗜寒涼，常吃零食，或患病用藥，損傷脾氣，脾虛木乘，肝風內動，加之脾失運化水濕，終致風痰內擾[17]。基于上述，并結合兒科宗師錢乙的“五臟證治理論”解析TD，認為該病與體質相關，病位責之于五臟，主要在肝，與脾關系密切，初步總結出“脾虛肝亢、風痰內擾”是TD的主要病機，可從肝脾論治，這與當代很多醫家學術思想一致，并且符合“五臟有余不足論”[18-22]。

2 病證結合動物模型的建立

既往動物模型多局限于“病”的復制，故不能觀察中醫證候演變，亦無法體現中醫的辨證論治。現代醫學之“病”結合中醫之“證”建立的病證結合動物模型，有利于探索疾病及其演變過程與證候之間的關聯性，并將動物研究更貼近人類疾病的臨床診治，是當前動物模型研究中較為理想的造模方法，并隨著部分病證結合動物模型的日趨成熟，填補了“一證一個體”基礎研究的空白[23-24]。

2.1 實驗動物的選擇 考慮到抽動表型的高度復雜性，動物方面通常采用哺乳動物，包括小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、貓和猴子，其中以嚙齒類動物小鼠、大鼠為主，主要是基于它們具有很高的成本效益和與人類神經生物學高度相似性[25]。基于人群和雙胞胎家庭的研究驗證了TD的遺傳學基礎，隨著二代測序及全基因組的廣泛應用，推翻了TD符合孟德爾遺傳規律的單基因遺傳病假說，不僅增加了大量候選基因，而且制備了基因突變及基因敲除動物模型[26-27]。故基因變異動物已逐步擴展應用，但多出現在國外的基礎研究中。

2.2 TD“病”模型的制備 目前國內外的TD動物模型大致分為基因、環境因素暴露及藥理學3大類，其中基因模型和環境因素暴露模型是國際研究熱點，前者因更能明確造模目的及藥物作用靶點、符合模型評價的結構有效性和預測有效性，故應有最多，主要包括SLC6A3、MAOA、CNTNAP2、SLITRK、HDC、NLGN、SAPAP3和D1CT-7等基因模型[28]，但缺點是表面有效性不能完全符合且價格昂貴。環境因素暴露模型(多發生于孕期和圍產期)主要包括早期應激和產科因素模型、早期神經炎癥模型，在發病因素研究中應用最多。目前國內基礎研究使用最多的是藥物模型，主要使用苯丙胺(Amphetamine，AMP)、阿撲嗎啡(Apomorphine，APO)、2，5-二甲氧4-碘苯-2-氨基丙烷(2,5-dimethoxy 4-iodobenzene-2-aminopropane，DOI)、亞氨基二丙腈(Imino Dipropionitrile，IDPN)、6-羥基多巴胺氫溴酸鹽(6-Hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA)、谷氨酸等實現模型制備，具體如何操作不再贅述，在中醫藥實驗研究中IDPN模型應用最多。但是，上述三大類TD動物模型并沒有和中醫的“證”相結合，只是進行“病”的模型制備。

2.3 脾虛肝亢證的“證”模型的制備 李繼君等[23]制備脾虛肝亢證TD動物模型方法：采用血清微量灌注技術，將該證候患者未稀釋血清微量灌注于Wistar大鼠腦內，1例血清僅用于1只大鼠。該方法從刻板動作進行了主癥的表面有效性分析，寧動顆粒干預后TD大鼠刻板動作減少,從主癥的角度預測模型有效性。寧動顆粒以鉤藤、天麻、黨參、麥冬為君，以龍骨、牡蠣為臣，以白芍、甘草為佐使之藥，從柔肝平肝角度進行肝亢的有效性預測，尚缺乏脾虛癥狀及其評估。陳自佳[24]制備小鼠模型方法：腹腔注射IDPN 350 mg/(kg·d)誘導當日，結合濃度為1 g/mL的番瀉葉顆粒劑溶液20 mL/(kg·d)、50 mL/(kg·d)及大黃顆粒劑溶液50 mL/(kg·d)灌胃，連續8 d，最終發現大黃組表面有效性及結構有效性最佳。在主癥方面從自主活動和刻板動作進行分析，兼癥從食欲不振(食量減少)、消瘦(體質量下降)、大便溏泄(排便次數增多，便形溏稀，肛門污穢)、倦怠乏力(懸空拉尾抵抗力減弱)、毛發不榮、拱背、萎靡嗜睡進行脾虛癥狀評估，從胸腺及脾臟指數、胃泌素、D-木糖等指標進行病理學評估。通過健脾止動湯進行有效性預測評估，方中太子參、茯苓、甘草益氣健脾，陳皮理氣健脾、和中化滯，半夏辛溫燥濕化痰、辛行苦泄，川芎、防風等清肝瀉火。劉曉芳等[29]制備大鼠模型方法：腹腔注射IDPN 300 mg/(kg·d)誘導當日，結合飲食失節、慢性束縛以及過度疲勞。該方法在主癥方面從自主活動和刻板動作進行分析，在兼癥方面，從神疲氣短、少氣懶言、食少便溏等進行脾虛證的驗證。在有效性預測方面通過自擬方干預后自主動作和刻板動作減少，方中四逆散加減以透邪解郁、調和肝脾，升降散加減以宣發郁熱、調暢氣機，烏梅丸加減以調和陰陽、柔肝息風，從疏肝平肝達“總以調暢氣機為要”，并通過血清中腦源性神經營養因子進行結構有效性及有效性預測評估。TD基本病機為肝風內動，和肝亢關系密切。如上所述，這3種方法均對主癥表面有效性進行評估，并進行了有效性預測評估，后2種方法進一步評估了結構有效性，并從脾虛方面評估其表面有效性，但肝亢癥狀驗證不足。整體上，第2種方法最為全面地從“證”的模型構建進行評估，選用方劑以四君子湯為主，從健脾入手進而扶土抑木、化痰熄風，最貼切其脾虛肝亢、風痰內擾證的發病機制。

3 病證結合動物模型的評價體系

3.1 宏觀表征 根據中醫辨證思維，中華中醫藥學會兒科分會臨床評價學組發布的《兒童抽動障礙中藥新藥臨床試驗設計與評價技術指南》將脾虛肝亢證TD定義為：主癥：1)腹部抽動明顯；2)手腳多動，難于靜坐；3)注意力不集中。兼癥：1)性情急躁；2)煩躁易怒；3)睡眠不安；4)多夢；5)目赤；6)口苦；7)嘆息；8)脅脹；9)健忘；10)食欲不振；11)便溏。舌脈：舌淡紅，苔薄白；脈細弦。具備主癥1)，兼癥6項，參考舌脈即可辨證[30]。“有諸內者，必形諸外”，該評價方法以中醫基礎理論為根本，通過四診合參信息反映中醫病證本質。目前研究多通過行為學測定、自主活動儀檢測、刻板運動觀察評分這3個方面進行主癥評價，滿足模型表面有效性評估[24]。脾虛兼癥通過模型動物的活動活躍度、形態變化、毛色順滑度及體表被毛性、飲食量、排便次數及腹形大小等判定[24]，但部分兼癥(尤其是肝亢癥狀)以及舌脈無法評定。由上可見，病證結合動物模型雖能夠最大限度模擬，但因為病證復雜、不斷演變、個體差異以及癥狀和體征主觀判斷性強等特點，量化指標統計分析方面存在難度。從上述3種病證結合動物模型看，已經實現了主癥(如腹部抽動、手腳多動)及脾虛癥狀(食欲不振、便溏)的模擬，但肝亢癥狀(性情急躁、煩躁易怒、目赤、口苦等)目前暫未實現，提示了下一步研究方向。由此說明病證結合動物模型的評價體系尚未成熟，需要進一步完善。

3.2 微觀指標

在實際工作中無法將病證結合動物模型的宏觀表征等同于中醫特定的臨床證候，在實驗中研究者多結合病理生理學基礎，滿足模型結構有效性及預測有效性評估，體現將臨床證候相關的理化指標融入微觀層面的診治指標。筆者結合模型鑒定的3個要素把微觀指標分為3大部分，其中中樞神經病理生理學、理化指標用于“病”模型鑒定，非中樞神經指標用于“證”模型鑒定，這也體現了中醫基礎理論的整體觀，其中脾虛證的評估較為成熟，可供今后參考[24，29]，但肝亢證的微觀指標尚未在本病中報道。

3.2.1 通過中樞神經病理生理學變化進行“病”模型評價 病理生理學改變最能體現模型評價中的結構有效性，是模型鑒定的重要部分，多項研究通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色方法已驗證TD模型動物的神經病理改變，主要觀察海馬CA2區、門區及齒狀回神經元結構及數目是否出現改變。海馬CA2區錐體細胞排列紊亂，數量減少，部分細胞出現空泡變性，大量細胞出現核固縮壞死，門區錐體細胞排列紊亂，大量神經元細胞腫脹、核固縮壞死，由典型的多角形變為三角形或不規則形，周邊膠質細胞浸潤，頂樹突明顯減少，排列混亂；齒狀回神經元壞死，大部分顆粒細胞濃縮、深染，細胞數量明顯減少，排列疏松[31]。

3.2.2 通過中樞神經理化指標變化進行“病”模型評價

3.2.2.1 多巴胺 多巴胺(Dopamine，DA)是由中腦為主的多個腦區的神經元產生，主要是黑質致密部(Substantia Nigra Pars Compacta，SNc)和腹側被蓋區(Ventral Tegmental Area，VTA)，并能投射支配許多大腦區域，包括紋狀體和其他基底神經節核、不同的額葉皮質區和部分邊緣系統。主要的DA能神經通路是黑質紋狀體通路(SNc→背紋狀體)、中間邊緣通路(VTA→伏隔核)和中間皮質通路(VTA→額葉皮質)。多個實驗研究已證實IDPN可干擾DA在機體內代謝，故使用此方法制備的TD模型組動物表現為DA及其多巴胺1型受體(DA Receptor Type 1，D1R)代謝產物高香草酸(Homovanillic Acid，HVA)升高，D2R、多巴胺轉運蛋白(Dopamine Transporter，DAT)、兒茶酚-O-甲基轉移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)降低，靜安口服液、菖蒲郁金湯、祛風止動方等可調控D2R、DAT、COMT進而下調DA表達以及HVA含量[32-34]。

3.2.2.2 5-羥色胺 5-羥色胺能神經元(Serotoninergic Neuron，SN)是以5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)為遞質的神經元，主要集中于腦干的中縫核，并投射到紋狀體、黑質及皮層，支配神經系統的所有區域。既往研究表明TD患者血漿色氨酸水平明顯降低，推測與5-HT代謝酶合成過多或誘導性過高有關，進而推論TD與5-HT代謝紊亂有關，并且下游產物5-羥吲哚乙酸也可反映5-HT的代謝水平。DOI是選擇性5-HT(2A/2C)受體激動劑，故多采用DOI模型觀察5-HT含量變化，而中藥干預可起到上調作用[32]。5-HT在腦的高級部位和多種神經活動方面起著普遍的抑制和穩定作用，故在TD合并強迫癥的研究中應用最多，并有學者正在研究該指標與睡眠障礙之間的關聯性。

3.2.2.3 去甲腎上腺素 產生去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)的神經元位于腦干，投射廣泛，支配所有中樞神經系統區域。實驗證明IDPN模型組大鼠腦組織及血漿的NE水平較正常對照組顯著升高，菖蒲郁金湯能一定程度上降低NE能神經元興奮性，通過抑制NE表達從而達到抗抽動效應[33]。DA是合成NE的前體，影響DA代謝的藥物也可能影響NE的水平，產生NE的神經纖維與產生DA、乙酰膽堿和5-HT的神經元相互連接。因此，自然發生的改變和藥理學誘導的NE信號變化都可能導致其他調節途徑的復雜改變，而NE水平的降低可抑制行為、提高注意力及記憶力。

3.2.2.4 氨基酸類神經遞質 氨基酸類神經遞質改變作為TD的病理生理學基礎，因與中醫的陰陽平衡理論相似是近年研究的熱點之一。氨基酸本身作為一種神經遞質及多種神經遞質的前體物質和中間產物，參與神經系統的營養發育及信息的傳遞、整合。既往研究已證實，TD模型動物腦組織及血樣中興奮性氨基酸谷氨酸(Glutamic Acid，GLU)、谷氨酸轉運蛋白(Glutamate Transporter 1,GLT1)、興奮性氨基酸轉運體(Excitatory Amino Acid Transporter2,EAAT2)升高，抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric Acid，GABA)降低[35]，而健脾止動湯可下調GLU[36]和EAAT2[37]，進一步闡述通過調節陰陽可抑制神經興奮性，因此以氨基酸類神經遞質作為靶點的研究廣泛用于TD及注意力缺陷多動障礙的基礎研究及新藥制藥領域。

目前采用藥理學模型觀察理化指標變化在國內應用較多，同樣也是藥物機制研究的熱點模型。在基礎研究中學者多采集紋狀體、皮質、腦脊液的透析液、血液作為標本進行神經遞質指標檢測，在方法上神經遞質采用高效液相色譜法和(或)酶聯免疫吸附試驗法，而受體、轉運體等關鍵蛋白采用蛋白質印跡法、熒光定量PCR等方法，亦有采用MicroPET技術檢測DAT報道。除此之外，基于強啡肽[38]、下丘腦-垂體-腎上腺軸[39-40]、下丘腦-垂體-性腺軸進行的動物實驗較少，但后二者在臨床研究中應用較多。目前通過上述病理基礎對TD疾病模型的有效性評估較為成熟[41]，但用于脾虛肝亢證TD病證模型方面較少[42]。不同證型差異性研究暫空白，今后可將中樞神經病理生理學和神經理化指標用于疾病模型評價。

3.2.3 通過非中樞神經指標變化進行“證”模型評價

3.2.3.1 脾臟和胸腺指數測定 脾臟和胸腺是2大免疫器官，前者為中樞細胞免疫，后者為外圍免疫器官，二者結構變化及功能高低直接影響機體免疫水平，多位學者認為這2項指數可作為判斷脾虛相關證候的病理指標。陳自佳[24]和劉曉芳等[29]的實驗表明中醫證型組和模型組動物脾臟和胸腺指數較空白組下降，再次驗證二者的直接關聯性。

3.2.3.2 胃泌素和D-木糖濃度測定 胃泌素(Gastrin，GAs)又稱促胃液素，直接參與消化道結構與功能的發育和成熟，是反映胃蠕動及胃動力學的關鍵指標，因能促進胃排空和激發胃竇平滑肌收縮反應，被認為是脾虛肝亢證的病理基礎，另有用于脾虛肝郁證的報道[29]。D-木糖能客觀體現消化吸收功能，從中醫角度上講，脾主運化水谷，并將精微物質散布至五臟六腑及四肢末節，正與上述的消化吸收相吻合，故D-木糖被認為是與小腸吸收功能和脾虛證呈正相關的敏感和特異指標，并在基礎研究中得到證實[24]。

4 小結與討論

在TD模型的3種制備方法中，藥理學模型因最能體現表面有效性、結構有效性、預測有效性的3種評價，在國內最為肯定且使用最多，故以此為背景淺談脾虛肝亢證TD病證結合動物模型的相關研究。目前國內外已經能根據藥理學模型進行不同神經遞質變化的研究，如觀察藥物是否通過調控DA起到治療作用時需選用IDPN模型，而關于5-HT的機制研究需選用DOI模型，但尚未有能將每種神經遞質對應其自身的藥理學模型。另一不足之處是藥理學模型與中醫的“證”尚未建立對應關系，在“病”模型制備的同時需要“證”的構建。在“證”構建方面，脾虛證的構建和評價方法很多，但關于脾虛肝亢證的較少，嚴格意義上講，用于TD的僅有2個，文獻中涉及的通過大黃、大承氣湯、飲食偏嗜、勞倦及利血平等方法制備的脾虛證模型是否能用或者如何用于脾虛肝亢證TD模型制備尚不可知[43]，如何根據基因模型進行病證結合動物模型制備也有待于進一步探討[44]。模型評價是基礎研究的重要部分，既往研究已表明，在宏觀表征方面研究者能分別通過“病”和“證”對脾虛肝亢證TD進行簡單模型評價；在微觀指標方面，中樞神經病理生理學改變在多項基礎研究中得到證實，有助于結構有效性評價。用于臨床的理化指標在動物體內不能一一被復制，但已經在動物實驗中驗證的中樞神經遞質可基本滿足“病”模型的評價，其中IDPN/DA和DOI/5-HT的關聯性是需要注意的，并且IDPN干預后的實驗鼠體質量降低提示IDPN模型本身具有體質量下降這一體現脾虛證的特征，更適合脾虛肝亢證TD疾病模型制備[24]。脾臟和胸腺指數測定、胃泌素和D-木糖濃度測定目前已被驗證可確切用于脾虛肝亢證TD基礎研究中，但伴隨脾虛肝亢這一“證”構建的日益成熟，后續會不斷出現評價“證”的宏觀表征和微觀指標。

TD動物模型的研究可提高醫學者對本病的認識和研究水平，成為探索神經精神系統與TD發病聯系的關鍵點。中醫病證結合的動物模型可彌補西醫“病”模型和單因素的中醫病因病機“證”模型的不足，且更具說服力，是臨床診斷治療及新藥研發的基礎[45]。通過脾虛肝亢證TD病證結合動物模型的文獻回顧性分析發現，對于“證”的構建、評價和如何將“病”和“證”更好地結合仍存在局限性。同時為了使實驗研究更貼近臨床療效，怎樣建立“證”的量化評價體系，進一步提高中醫藥建設的現代化和科學化，是我們要繼續努力的方向。