基于網絡藥理學探討黃芪-丹參藥對治療肝癌的作用機制與實驗驗證

蘇曉鵬 晏 軍 張潞潞 李玲孺 黨志博 李 玲 周怡馳 胡世平

(1 北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700； 2 北京中醫藥大學，北京，100029； 3 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京，100700； 4 北京中醫藥大學深圳醫院肝病科，深圳，518172)

原發性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma，PHC)是指發生于肝細胞或肝內膽管上皮細胞的一種常見惡性腫瘤，其發病率及病死率均較高，國際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)2018年報告指出肝癌發病率位于第6位，病死率位于第4位，男性癌性死亡位于第2位[1]?，F代醫學針對此病最有效的治療方法是肝切除術、肝移植，但是該病起病較隱匿，早期癥狀不典型，且病情進展迅速，僅有不到30%的患者得到了最佳治療[2]。絕大數患者錯過最佳治療時機，從而選擇射頻消融術(Radio Frequency Ablation,RFA)、經導管動脈栓塞化療(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)以及放射治療，這些治療可以提高患者的生存率，但是在治療過程均會產生一些不良反應，如發熱、頭痛、惡心、嘔吐等[3]。

中醫學對肝癌的認識歷史悠久，內容豐富。肝癌的臨床表現在中醫古代文獻中的記載散見于“伏梁”“肝積”“癥瘕”“積聚”“鼓脹”“肥氣”等病，如《難經·五十六難》中記載“肝之積，名曰肥氣。在左脅下如覆杯，有頭足”?，F代醫家結合患者的臨床表現，認為該病的病理性質為虛實夾雜，同時依據《黃帝內經》有“邪之所湊，其氣必虛”和“壯人無積，虛人則有之”的理論,多數醫家認為正氣虧虛是該病發生的核心病機[4]。氣是構成也是維持人體生命活動重要的物質，氣一旦失常，可引起各種病理反應，如氣虛血郁、氣虛痰郁、氣滯毒瘀等。因此在臨床治療時，大多醫家以“扶正解毒”為大法治療肝癌患者，皆取得較好的療效[5-6]，同時在中西醫結合治療肝癌的研究中發現中醫治療可大大降低西藥治療的不良反應[7-8]。

針對肝癌的核心病機，臨床醫家常用黃芪扶正治肝癌[9]。黃芪性甘微溫，質輕升浮，具有補氣升陽、補脾益肝等功效?！侗静菥V目》記載“黃芪甘溫純陽，其用有五：補諸虛不足，一也；益元氣，二也；壯脾胃，三也……活血生血”，由此可見黃芪乃“補氣之長”。此外重用黃芪還有利于增強肝的疏泄功效，名醫張錫純在《醫學衷中參西錄》中講到“肝屬木而應春令，其氣溫而性喜條達，黃芪之性溫而上升，以之補肝原有同氣相求之妙用”。在黃芪扶正基礎上加用丹參治療肝癌之“毒”，丹參性苦，微寒，具有活血祛瘀、消腫止痛等功效。前人有“一味丹參，功同四物”之說，可見其活血而不傷正氣，用其治療肝癌本虛有瘀毒者最為合適，再者黃芪配合丹參，可以使黃芪補而不滯。黃芪和丹參治療肝癌以及其他腫瘤的藥理學研究較多[10-12]，但是黃芪和丹參藥對是如何發揮抗肝癌的作用機制仍未闡明，本研究借助網絡藥理學的方法，以黃芪-丹參-肝癌為研究對象，構建中藥藥對、化學成分、基因靶點、相關通路之間的關聯性，初步揭示黃芪-丹參治療肝癌的作用機制，并通過體外實驗驗證相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞HepG2,由中國科學院基因所饋贈，并由上海富衡生物科技有限公司鑒定，鑒定編號:20171012-01。

1.1.2 藥物 黃芪-丹參藥對藥液：黃芪30 g、丹參20 g。均購自三九藥業，批號分別為：2101002W、2012007W。取稱量紙一張，用電子天平稱取0.5 g黃芪-丹參顆粒溶解于10 mL細胞高糖培養基中，用10 mL注射器與0.22 μm除菌過濾器將溶解好的液體過濾至新的15 mL離心管中，即為黃芪-丹參藥對藥液，存于4 ℃冰箱。

1.1.3 試劑與儀器 澳洲胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培養基(Gibco，美國，批號：1009-141、C11995500BT)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA)(北京鼎國生物技術有限公司，批號：GP3108-100ML)；Cell Counting Kit-8(北京蘭博利德生物公司，批號：CK001-500T)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒[凱基生物(KeyGEN)公司，批號：KGA108-1]；實時PCR試劑盒(中國全式金公司，批號：AQ131-01)；超凈工作臺(廣州展晨生物科技有限公司，型號：SW-CJ-1FD)；CO2培養箱(三洋電機株式會社，日本，型號：SANYOXD-101)，細胞流式儀(BD公司，美國,型號：C6)；PCR儀[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，型號：C1000]。

1.2 方法

1.2.1 黃芪-丹參藥對的活性成分收集 本研究依據中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp)以Herb name檢索方式搜集黃芪、丹參藥對的活性成分[13]。并依據成分毒藥物動力學(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME)將搜集到的活性進行篩選，篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18。除此之外查閱相關文獻補充數據庫的不足。

1.2.2 建立黃芪-丹參藥對活性成分基因靶點庫及相應網絡構建 將篩選出來黃芪-丹參有效成分分別帶入TCMSP平臺的Related Target中，搜集相應的標準蛋白名。隨后利用Unitprot(https://ebi14.uniprot.org)數據庫查詢靶點的標準蛋白和基因名，并對黃芪-丹參藥對的標準蛋白進行相應的基因匹配。

1.2.3 肝癌疾病相關靶點的收集 在Drugbank數據庫(https://go.drugbank.com)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、治療性靶標數據庫(Therapeutic Target Database，TTD)、人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org)系統中以“Liver Cancer”為檢索詞查詢肝癌疾病基因靶點，將上述數據庫檢索的基因靶點匯總并刪除重復值。

1.2.4 核心靶點基因蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡構建 將黃芪-丹參藥對與肝癌疾病的交集靶點上傳至String 11.0(http://string-db.org)數據庫構建PPI網絡，調制物種名為“Homo Sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，其余設置選項設為默認值后進行藥物成分蛋白和疾病蛋白的相互作用分析，隨后將得到的PPI通過Cytoscape 3.8.0軟件達到網絡的可視化，并進行網絡分析。

1.2.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 使用Metascape(http://metascape.org)數據庫對黃芪-丹參藥對作用于肝癌的潛在靶點進行GO與KEGG富集分析，設置閾值P<0.05，初步預測黃芪-丹參藥對治療肝癌的相關作用機制。運用Metascape數據庫，從生物過程(Biological Processes，BP)、分子功能(Molecular Functions，MF)、細胞組分(Cellular Components,BC)3個方面對黃芪-丹參藥對治療肝癌的交集基因進行CO功能富集分析。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞活力 將96孔板分為9組，每組6個復孔。第1組為無細胞的空白對照，第2組為無藥液的純細胞對照組，黃芪-丹參藥液對應的余下8組分別為：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。隨后用已孵育48 h的細胞計數種板，每孔1萬個細胞于100 μL培養基，每組先配制好該組所需要孔數的細胞懸液和藥液再進行種板。96孔板種好后放入二氧化碳培養箱中孵育。48 h后，將提前融化好的CCK-8溶液于每孔中加入10 μL，于培養箱中孵育2～4 h；2～4 h后，用熒光化學發光儀中的Ascent Software Version 2.6軟件在450 nm波長處測定吸光值，進行熒光強度數據的讀取和保存。

1.2.7 Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡 細胞培養48 h后用不含EDTA的胰酶消化2 nim，隨后用含血清培養基終止胰酶消化，以1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min后棄上清，并用1 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗1～2次，再次以1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min后棄上清液；用1 mL 1×結合緩沖液Binding Buffer加入離心管并重懸細胞,使細胞的密度達到1×106個/mL。隨后向預先標記好的流式管中加入100 μL細胞(1×105個)，并依次向流式管內加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光后再加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide,PI)，室溫避光，染色5 min，最后向管內加入PBS保證每個流式管的含細胞液體體積為500 μL，輕輕混勻。在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.2.8 PCR實驗檢測基因 根據樣本數計算所需板孔，每個樣本做3個復孔。稀釋樣本：稀釋5倍，加DEPC水80 μL于逆轉錄好的cDNA中并混勻。引物稀釋：按照引物說明書稀釋引物。配制混合物：每孔：前引物1 μL，后引物1 μL，TBGreen 10 μL，H2O 6 μL，共18 μL。根據排板，每孔加入2 μL cDNA樣本和18 μL上述配好的混合物。震蕩混勻，上機反應、檢測。使用兩步法PCR擴增標準程序。2-△△Ct法計算相對量為結果進行統計分析。引物序列見下表1。

表1 實時PCR引物序列

2 結果

2.1 黃芪丹參藥對活性成分篩選結果 得到黃芪有效成分20個，黃芪活性成分22個。丹參活性成分65個，其中黃芪無靶點活性成分5個，丹參無靶點活性成分6個，最終篩選得到76個活性成分。見表2。隨后利用Cytoscape繪制中藥-成分-靶點圖，繪制過程計算Degree值，通過比較Degree值大小后發現槲皮素、毛蕊異黃酮、沒食子酸酯、丹參新醌為主要活性成分。見圖1。

表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

續表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

續表2 黃芪-丹參主要活性成分及OB和DL值

圖1 黃芪-丹參有效成分-靶點網絡

2.2 黃芪-丹參藥對治療肝癌的靶標篩選 刪除重復靶點后黃芪丹參藥對共216個靶點。通過多個疾病靶點數據庫以“Liver Cancer”為檢索詞檢索共獲得1 310個靶點。最后通過構建韋恩圖，從中獲得黃芪-丹參藥對和肝癌疾病共同靶點118個，即核心靶點。見圖2。

圖2 黃芪-丹參藥對與肝癌疾病的韋恩圖

2.3 PPI網絡的構建 共形成283個PPI關系對，平均連接度為6.99。見圖3。處于節點度前10位的蛋白為AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。這些靶蛋白可能是黃芪-丹參藥對治療肝癌的最為緊要的核心靶點。

圖3 黃芪-丹參藥對與肝癌疾病核心靶點PPI網絡

2.4 GO功能富集分析 黃芪-丹參藥對主要參與的生物過程為對細胞凋亡信號的應答過程(Apoptotic Signaling Pathway)、對無機物質的應答(Response to Inorganic Substance)、細胞對有機環狀化合物的應答(Cellular Response to Organic Cyclic Compound)、對有毒物質的反應(Response to Toxic Substance)、細胞對脂質的應答(Cellular Response to Lipid)。分子功能集中在轉錄因子結合方面(Transcription Factor Binding)，其細胞組分主要集中在膜筏(Membrane Raft)和轉錄因子(Transcription Factor Complex)。見圖4。

圖4 GO(BP、CC、MF)功能富集分析柱狀圖

2.5 KEGG富集分析 結果顯示黃芪-丹參藥對主要通過作用于癌癥相關通路(Pathways in Cancer)、乙型肝炎相關通路(Hepatitis B)、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、PI3K-AKT通路、HIF-1信號通路等治療肝癌。見圖5。

圖5 KEGG分析富集氣泡圖

2.6 黃芪-丹參藥對HepG2肝癌細胞活力影響 48 h后的細胞活力除25 mg/L、50 mg/L組對細胞活力無影響外，其余組均有影響，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖6。其中150 mg/L組以后細胞活力均小于50%，故選用150 mg/L、300 mg/L作為黃芪-丹參藥對低和高劑量。

圖6 黃芪-丹參藥對對HepG2細胞活力48 h的影響(n=6)

2.7 黃芪-丹參藥對對HepG2肝癌細胞凋亡影響 黃芪-丹參藥對對HepG2細胞的48 h凋亡率的影響通過Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測，與空白組發現黃芪-丹參藥對可以促進腫瘤細胞凋亡，且對腫瘤細胞的凋亡率具有藥量依賴性.見表3、圖7。

表3 黃芪-丹參藥對對HepG2細胞凋亡率(%,n=3)

圖7 黃芪-丹參藥對對HepG2細胞凋亡48 h的影響

2.8 黃芪-丹參藥對PI3K、AKT基因的影響 通過實時PCR技術分析黃芪-丹參藥對干預48 h后對HepG2細胞的PI3K/AKT信號通路相關基因PI3K及AKT的mRNA表達的影響。與空白組對比發現，黃芪-丹參藥對低劑量和高劑量預均可下調PI3K及AKT的mRNA表達水平，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 黃芪-丹參藥對對PI3K/AKT信號通路相關基因mRNA相對表達

3 討論

隨著肝癌的患病率、病死率逐年增高[1]，針對“肝癌”的相關研究越來越多，中醫學具有悠久的歷史，且在實踐治療中起到了非常重要的作用，備受研究者重視。中藥成分具有抗癌的作用。本研究發現黃芪-丹參藥對在治療肝癌中發揮作用的主要成分是槲皮素、毛蕊異黃酮、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、丹參新醌。周孟等[15]通過動物實驗證明，槲皮素可抑制體內外HepG2肝癌細胞的增殖并會促進其發生凋亡，除此之外還發現槲皮素的不良反應幾乎為零。陳麗等[16]通過細胞實驗證明表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過下調肝癌細胞的自噬從而有效抑制癌細胞增殖、促進癌細胞死亡。毛蕊異黃酮、丹參新醌同樣也被證實有抗癌的作用[12]。除此之外，本研究篩選后得到黃芪丹參藥對治療肝癌的靶點共118個，體現了黃芪丹參藥對治療肝癌具有多成分、多靶點協同作用的特點。

通過構建的PPI網絡對118個靶點進一步研究發現黃芪丹參藥對治療肝癌的基因靶點相互作用密切，主要參與的基因靶點包括：AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL-6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。AKT1是一類蛋白激酶，主要影響細胞的增殖和生長，研究表明其具有調控肝癌細胞增殖的功效[17]。白細胞介素-6作為炎癥介質，除參與炎癥反應外，近幾年研究發現白細胞介素-6通過參與肝癌微環境構成、調控下游轉錄因子、激活相關通路等影響腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，據此也成為肝癌靶向治療的一個熱點[18]。MAPK1、MAPK8、MAPK14均為MAPK家族的一員，現代研究發現MAPK信號通路是細胞內非常重要的信號通路，不僅參與正常組織細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程，而且也參與各種腫瘤的病理過程[19]。JUN、ESR1皆為染色體上的基因，JUN編碼一種與病毒蛋白高度相似的蛋白，在我國慢性乙型肝炎病毒感染是肝癌的主要病因，研究發現，85%肝癌患者乙型肝炎病毒感染陽性[20]。ESR1編碼雌激素受體，研究表明肝臟中雌激素在與雌激素受體結合后才具有抗氧化、抗肝纖維化、抗癌等功效[21]。表皮生長因子受體是人表皮生長因子受體家族成員之一，研究發現表皮生長因子受體過表達可引起肝癌，西妥昔單抗通過抑制表皮生長因子受體及其受體結合發揮抗腫瘤作用。此外體外細胞實驗證明黃芪丹參藥對可以抑制HepG2細胞活力。因此，黃芪丹參藥對可能主要通過影響肝癌細胞增殖以及促進相關受體結合發生抗肝癌的作用。

GO富集分析后發現：黃芪丹參藥對主要細胞組成集中在膜筏和轉錄因子上，而分子功能也集中在轉錄因子結合方面，主要參與了細胞凋亡信號的應答過程。KEGG通路富集分析結果提示黃芪丹參藥對主要通過癌癥相關通路、乙型肝炎相關通路、TNF信號通路、PI3K/AKT信號通路等發揮抗癌作用。研究表明，某些轉錄因子通過調控增殖和凋亡相關基因，進而調節腫瘤的發生發展[22]。本研究發現黃芪丹參藥對治療肝癌的核心靶點包括促分裂原活化的蛋白激酶1、促分裂原活化的蛋白激酶8、促分裂原活化的蛋白激酶14，皆參與細胞的增殖、凋亡，同時還參與了腫瘤的病理過程，這恰恰與KEGG富集結果中黃芪丹參藥對通過癌癥相關通路起效相互印證。Jun激酶編碼病毒蛋白，或許黃芪丹參藥對正是通過乙型肝炎相關通路抑制Jun激酶的作用降低乙型肝炎病毒感染發揮作用，這樣在抗肝癌的治療過程中還可以起到抗病毒的作用，現代藥理學研究也證實二者可以抗乙型肝炎病毒[23]。PI3K/AKT信號通路近年來被視為調節腫瘤的主要通路[24]，本研究發現黃芪丹參藥對可以減少PI3K和AKTmRNA的表達，由此可見黃芪丹參藥對發揮抗腫瘤作用與該通路密切相關。

總之，經網絡藥理學分析后，黃芪丹參藥對治療肝癌具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，可以確定中藥療效的客觀性。經體外細胞實驗初步明確黃芪丹參藥對可以抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，并且與PI3K/AKT信號通路密切相關。但是仍需要進一步通過細胞實驗或動物實驗對該藥對成分以及其他靶點、通路進行驗證，為中藥治療肝癌提供更加有力的證據，以便使中藥更好地運用于腫瘤治療中。