基于P糖蛋白研究仙茅對順鉑耐藥非小細胞肺癌細胞的增敏機制

郝 雨 朱寶琛 薛春苗, 華國棟 高若瑜 黃 鑫 劉文卉 王 萌

(1 北京中醫藥大學中藥學院，北京，102488； 2 北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700)

近年來，全球肺癌死亡人數居癌癥之首[1]，順鉑(Cisplatin)為肺癌化療的一線用藥[2]，然而，化療僅初始治療效果明顯，長期治療效果并不理想，且在接受化療后高達90%的肺癌患者最終復發[3-4]。非小細胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)的繼發性化療耐藥嚴重影響了肺癌的臨床治療效果。同時，耐藥細胞富集了癌癥干細胞樣的特性，更易于復發和轉移[5-7]。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，又稱為多藥耐藥蛋白1(Multidrug Resistance Protein 1，MRP1)，是最早被發現的ATP結合盒(ATP-binding Cassette，ABC)轉運蛋白，在人體由ATP結合盒B亞家族成員1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1)基因編碼，是ATP依賴性的多藥外排泵，主要起跨膜轉運作用[8]。P-gp普遍表達于NSCLC病理組織中[9]。因而，抑制腫瘤組織P-gp表達的藥物聯用策略有望提高NSCLC對順鉑的敏感性，提高腫瘤抑制率。

現代藥理學研究表明，中藥仙茅具有一定的抗腫瘤活性，如盧逸儒等[10]研究發現仙茅水煎液在體外對鼠源S180、MFC細胞，人源SGC-7901、SMMC-7721細胞均具有較好的抑制作用；在小鼠體內實驗中，對S180、MFC移植瘤均有顯著抑制作用。彭梅等[11]研究發現熱水浸提的仙茅多糖對S180移植瘤小鼠有較好的抗腫瘤作用。同時仙茅能夠調節免疫功能，可改善化療導致的免疫功能降低，是中藥抗腫瘤的潛在藥物之一[12-15]。課題組前期研究發現苔黑酚葡萄糖苷(Orcinol Glucoside，OG)是仙茅水提取物中含量較高的主要成分之一，且是仙茅主要入血成分之一[16]。目前，國內外尚無仙茅影響腫瘤耐藥的相關研究，本文以NSCLC順鉑耐藥細胞A549/cis為研究對象，觀察仙茅水煎液及OG對腫瘤細胞耐藥性和P-gp表達的影響，為仙茅在抗肺癌耐藥中的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 A549/cis細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心(資源編號：1101HUM-PUMC000519)

1.1.2 藥物 仙茅(北京盛世龍藥業有限公司，批號：1911151)，苔黑酚葡萄糖苷(成都植標化純生物技術有限公司，批號：220123)，順鉑注射液(江蘇豪森藥業集團有限公司，國藥準字H20040813)。

1.1.3 試劑與儀器 1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution，PBS)(0.01 mol/L，pH 7.22～7.4，批號：20211222)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)消化液(胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmol/L，批號：20220217)、RPMI 1640培養基(批號：20210909)、二甲基亞砜(細胞培養級，批號：1209M0312)、二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：20210922)、高效RIPA組織/細胞裂解液(批號：R0010)、5×蛋白質上樣緩沖液[含二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)](批號：20220106)、彩虹245廣譜蛋白Marker(11～245 kDa，批號：PR1920)、一抗稀釋液(批號：A1810)均購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：21110701)，PAGE凝膠快速制備試劑盒(7.5%，批號：PG111)、脫脂奶粉(批號：PS112L)均購自上海雅酶生物科技有限公司，ECL化學發光底物試劑盒(超特敏)(北京蘭杰柯科技有限公司，批號：21299536)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride，PVDF)膜(0.45 μm，Merck Millipore Ltd.，德國，批號：R1CB66016)，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(批號：AB0101)、Beta Actin Antibody(批號：AB0035)均購自上海泊灣生物科技有限公司，CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司，批號：CK04]，Anti-P Glycoprotein抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab235954]；CO2細胞恒溫孵育箱(SANYO公司，日本，型號：MCO-20AIC)，倒置相差顯微鏡(Leica公司，德國，型號：DMi1)，恒溫預熱水箱(天津泰斯特儀器有限公司，型號：HHW21.420AII)，全自動酶標儀(Thermo公司，美國，型號：VLBLATD0)，超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司，型號：DL-CJ-2NDⅠ)，全自動化學發光圖像分析系統(Tanon公司，型號：5200)，加熱型恒溫金屬浴(OHAUS公司，型號：HB2DGHL)，電泳電源(基礎型)(北京龍方科技有限公司，型號：LF—600)，電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：AL20]，托盤天平(寧波浪力儀器有限公司，型號：11004)，臺式離心機(中國雷勃爾公司，型號：LD5-2)，低溫高速離心機(Heraeus公司，德國，型號：Sepatech biofuge 28RS)，高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司，日本，型號：MLS-3780)，超低溫冰箱(-80 ℃)(Thermo公司，美國，型號：900 SERIES)，純水機(Millipore公司，美國，型號：Mili-QA10+)，制冰機(SANYO公司，日本，型號：SIM-F124)。

1.2 方法

1.2.1 分子對接 使用帶有NVIDIA Geforce GTX1050Ti圖形卡和Core i5處理器的臺式計算機進行分子對接分析。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載OG的三維結構SDF文件(Compound CID：12315192)，經AutoDockTools(v1.5.6)加極性氫、分配電荷、設置可旋轉鍵后保存為“pdbqt”格式文件；利用PDB(https://www.rcsb.org/pdb/)蛋白數據庫下載P-gp的蛋白三維晶體結構PDB文件(PDB ID：5KPI)，使用AutoDockTools對結構進行添加極性氫、固定原子類型、固定鍵序、添加電荷、設置質子化狀態和刪除額外的水等處理并保存為“pdbqt”格式文件。使用目標活性位點中的共結晶配體生成結合口袋。用虛擬篩選軟件AutoDock Vina(v1.1.2)和Discovery Studio(v16.1.0)預測配體和靶點之間的相互作用。結果用預估的結合自由能表示。選擇結合能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)的對接結果進行結合構型和相互作用模式的研究，使用Discovery Studio對結果進行可視化。

1.2.2 仙茅水煎液的制備 稱取仙茅飲片64.04 g，加10倍量水浸泡1 h，煎煮0.5 h，趁熱過濾，再加入10倍量水煎煮0.5 h，趁熱過濾，合并兩次煎液，濃縮至1 L，即得。

1.2.3 細胞培養 A549/cis細胞在含15%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱培養，傳代周期為4 d(1∶3傳代)，待細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.4 細胞分組與給藥方法 A549/cis細胞依據實驗需要接種于96孔板或培養皿中，CCK-8分組：空白組、溶劑對照組、給藥組。給藥濃度：在藥物單用實驗中，順鉑梯度濃度分別為0、0.75、1.5、3、4、5、7、9、11、15 μg/mL，仙茅水煎液梯度濃度分別為10、50、100、500、750、1 000、1 250、1 500 μg/mL，OG梯度濃度分別為3×10-6、7×10-6、1×10-5、3×10-5、5×10-5、7×10-5、1×10-4、3×10-4mol/L[17-18]；放討論中在藥物聯用實驗中，順鉑高、中、低3個劑量(7 μg/mL、4 μg/mL、1.5 μg/mL)與仙茅水煎液高、低劑量(1 000 μg/mL、500 μg/mL)及OG高、低劑量(5×10-5mol/L、1×10-5mol/L)聯合給藥。蛋白質免疫印跡細胞分組：空白組、順鉑單用組、順鉑與仙茅水煎液聯用組、順鉑與OG聯用組；給藥濃度：順鉑1.5 μg/mL、仙茅水煎液1 000 μg/mL、OG 5×10-5mol/L。CCK-8與蛋白質免疫印跡法中藥物對細胞的作用時間均為48 h。

1.2.5 CCK-8法測定細胞活力抑制率 待細胞處于對數生長期，用0.25%的胰蛋白酶消化液(含EDTA)消化，離心半徑8 cm，1 000 r/min離心5 min，吸去胰酶后將細胞重懸，計數，調整細胞濃度，以10 000個細胞/孔種于96孔板，待細胞貼壁后進行分組給藥。實驗終點，吸去孔內液體，以PBS 100 μL/孔清洗1次，再加入100 μL CCK-8的完全培養基稀釋液(1∶10稀釋)，置培養箱孵育1～1.5 h后用酶標儀在450 nm下檢測吸光度，計算各孔的細胞活力抑制率，計算公式為：抑制率(%)=[(A空白組-A觀察組)/(A空白組-A溶劑對照組)]×100%。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法檢測P-gp的表達水平 取分組給藥完成的細胞，棄去培養基，用PBS清洗2遍，加入適量含蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(1∶1∶100)，在冰上裂解0.5 h、用細胞刮刀刮下細胞，收集于4 ℃預冷的1.5 mL離心管中，離心半徑10 cm，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入雙蒸水使得各組成等濃度的蛋白溶液，加入5×蛋白質上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min后，分裝并于-80 ℃保存。蛋白質免疫印跡法：每孔蛋白上樣量10 μg，用7.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉印于0.45 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗后一抗孵育過夜，TBST洗膜(10 min×3次)，二抗孵育2 h，洗膜，ECL顯色、曝光，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 P-gp與OG的模擬分子對接 P-gp與OG的結合自由能為-7.6 kcal/mol，表明二者可自發結合且有良好的結合活性。二者的分子對接圖和相互作用模式見圖1，結果顯示，P-gp可以同OG形成范德華力以及疏水作用從而發生穩定結合。OG主要在P-gp的A：GLU489、A：LYS911、A：GLN910、A：THR914、A：ASP490、B：ARG908殘基上形成氫鍵，與A：LYS911殘基上形成π-烷基相互作用力，使結合更加牢固[19]。由此，OG可能在機體中與P-gp結合而對其生物過程產生影響。

圖1 P-gp與OG的分子對接圖和相互作用模式

2.2 順鉑、仙茅水煎液、OG對A549/cis細胞活力的抑制率 順鉑對A549/cis的抑制率隨給藥濃度升高而增大，用Excel分析其曲線的線性趨勢方程，計算得到順鉑對A549/cis細胞的半抑制濃度(Half-maximal Inhibitory Concentration，IC50)約為5.5 μg/mL；各給藥濃度仙茅水煎液和OG對A549/cis細胞活力均沒有顯著影響。見表1。

表1 順鉑、仙茅水煎液、OG對A549/cis細胞活力的抑制率

2.3 順鉑與仙茅水煎液、OG聯用對A549/cis細胞活力的抑制率 與順鉑低劑量(1.5 μg/mL)單用組比較，聯用組抑制率均升高，其中順鉑與仙茅水煎液高、低劑量、OG高劑量聯用組升高顯著(P<0.05或P<0.01)；與順鉑中劑量(4 μg/mL)單用組相比，各聯用組抑制率均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與順鉑高劑量(7 μg/mL)單用組相比，其與仙茅水煎液高、低劑量、OG低劑量聯用組抑制率均升高，其中順鉑與OG低劑量聯用組升高顯著(P<0.01)，而順鉑與OG高劑量聯用組的抑制率則略微降低。見表2，圖2。

表2 順鉑與仙茅水煎液、苔黑酚葡萄糖苷聯用對A549/cis細胞活力的抑制率

圖2 順鉑與仙茅水煎液、苔黑酚葡萄糖苷聯用對A549/cis細胞活力的抑制率

2.4 順鉑與仙茅水煎液、OG聯用對A549/cis細胞P-gp表達水平的影響 順鉑(1.5 μg/mL)與仙茅水煎液(1 000 μg/mL)及OG(5×10-5mol/L)聯用組P-gp水平均低于空白組和順鉑單用組。其中與順鉑單用組比較，順鉑與仙茅水煎液聯用組P-gp表達水平降低顯著(P<0.05)。結果見表3，圖3。

圖3 順鉑與仙茅水煎液、OG聯用對A549/cis細胞P-gp表達水平的影響

表3 順鉑與仙茅水煎液、OG聯用對A549/cis細胞P-gp表達水平的影響

3 討論

2020年全球肺癌死亡人數約180萬(男119萬，女61萬)，有研究預估，由于人口老齡化、預期壽命延長等，2035年這一數字將增至約300萬(男210萬，女90萬)[20]，肺癌發病率的升高給社會和人民造成了沉重經濟負擔。由于肺部的感覺神經不發達，早中期的肺癌患者常無明顯癥狀，只有當腫瘤進展侵襲胸膜、支氣管、神經等部位時才會有胸痛、咳血等癥狀，故僅有約20%患者可于早期發現，大多數肺癌患者發現時都已是晚期，基本失去了手術的機會。在這種情況下，只能通過放化療來控制癌癥進展。但在臨床應用中發現，眾多患者首次化療敏感性高，隨后敏感性迅速降低，表明肺癌易產生繼發性耐藥，嚴重影響臨床結局。

氣陰兩虛、痰瘀毒聚是肺癌發病過程中的主要病機特征，而肺癌晚期患者往往由于氣陰兩傷日久，以致陰損及陽，陰陽兩虛。且晚期患者多僅能使用放化療方法進行干預，化療最主要的不良反應即為白細胞減少癥，中醫認為，脾腎陽虛是肺癌化療后白細胞減少癥發生的根源所在，故化療可導致晚期肺癌患者陽虛更甚。中藥仙茅為石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的根莖，藥性辛，熱，有毒，歸腎、肝經，具有補陽氣、強筋骨、祛寒濕的功效，對于經化療的晚期肺癌患者可以補陽扶正，促進陰陽平衡，增強免疫功能[15]，且研究證實仙茅亦有一定抗腫瘤作用[10-11]。本研究結果顯示，仙茅及OG單用并無顯著殺傷A549/cis細胞的作用，但聯用順鉑后可使順鉑對A549/cis的殺傷作用增強，提示仙茅及OG可從其他途徑增強順鉑的抗腫瘤作用。

NSCLC產生多藥耐藥性的作用機制尚不完全清楚，目前研究認為P-gp在其中起關鍵作用[21-23]，P-gp屬于ABC超家族，是ATP依賴性的多藥外排泵，主要起跨膜滲透泵作用，多項研究已證實P-gp與藥效減弱相關聯，未來ABC轉運體可能成為某些類型癌癥的生物標志物和治療靶點，在多藥耐藥中發揮臨床作用[8]。本實驗以中藥仙茅與順鉑聯用對肺癌耐藥細胞的作用為切入點，首先用模擬分子對接預測P-gp與仙茅有效成分OG具有良好的結合活性，再通過實驗發現仙茅水煎液和OG與順鉑聯用可以增大對A549/cis細胞的抑制率，并且二者可抑制A549/cis細胞P-gp的表達。以上研究結果表明仙茅對肺癌順鉑耐藥細胞有一定增敏作用，其機制可能與抑制耐藥細胞的P-gp表達相關，通過抑制P-gp表達，減少其對順鉑的外排，進而增強順鉑的抗腫瘤作用。然而，由于本研究僅在體外實驗中探討了仙茅及其入血成分對肺癌順鉑耐藥細胞的增敏作用，沒有進行體內研究，后續還需要開展動物實驗及臨床試驗對該方面進行深入探討，以進一步明確仙茅抗肺癌耐藥的作用機制，為發揮仙茅在抗肺癌耐藥中的臨床應用價值提供實驗支持。