固本健腦液對阿爾茨海默病大鼠學習記憶及睡眠時相的影響

毛劍琴 張譽丹 曾楚華 袁德培

(湖北中醫藥大學基礎醫學院，武漢，430065)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)發病癥狀呈持續性的腦部神經系統衰退，被普遍認為是海馬型遺忘綜合征，屬于癡呆癥最常見的病因之一，在全球范圍內占癡呆病例的50%～75%[1-2]。而全球人口老齡化發展也進一步促進了我國AD的患病率不斷上升，給家庭與社會帶來沉重經濟負擔的同時，也成為廣泛關注的醫學性問題。研究表明，不同程度的晝夜節律紊亂在AD患者和相關AD動物模型中均有體現，其中就包括行為學上的睡眠-覺醒節律紊亂、靜息-活動節律紊亂，也存在機體的一些激素的晝夜節律紊亂，AD患者的長期晝夜節律紊亂也可導致AD的病理進程加快，已證實約有44%的AD患者伴發有睡眠障礙[3-4]。而導致這一結果的發生正是由于在衰老過程中晝夜節律往往最先受累，因此在AD的發病過程中表現尤為突出[5]。國外學者也指出AD病情發展與睡眠障礙相關，并且睡眠障礙可能是導致AD的重要病因[6]。由AD導致機體靜息-活動晝夜節律紊亂是AD患者經常伴發的癥狀之一。因此，本實驗建立AD大鼠模型，并通過中藥固本健腦液予以干預，以期探討固本健腦液改善AD模型大鼠的晝夜節律紊亂。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 40只無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級雄性SD大鼠[海南醫學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(瓊)2019-0001]，體質量220～250 g，在指定條件下，室內溫度20～25 ℃；噪聲≤55 dB(A)；相對濕度：(55±15)%；光照強度：300 Lux，光照節律：07:00-19:00光照，19:00-07:00黑暗，明暗交替，于動物籠中適應性飼養1周后開始實驗。本實驗經過醫院倫理學委員會批準進行，各實驗操作均符合醫學倫理學要求(倫理審批號：2021-009)。

1.1.2 藥物 固本健腦液是由恩施板橋黨參15 g、枸杞子15 g、茯苓15 g、酸棗仁12 g、山楂12 g組成，購買于湖北民族大學附屬民大醫院，加入6倍量水后煎煮2次，濾出藥液(該過程重復2次)，將2次濾出來的藥液充分混勻，將其用旋轉蒸發儀高溫加熱濃縮成每毫升含生藥2 g的藥液，置于4 ℃冰箱內保存備用。褪黑素購于上海麥克林生化科技有限公司，生產批號:C13143553。超聲溶解混勻于純凈水中，實驗動物按0.09 mg/(kg·d)標準灌胃。

1.1.3 試劑與儀器 β淀粉樣蛋白1-42(β-amyloid Protein，Aβ1-42)(武漢艾迪抗生物科技有限公司，批號：AD21893)；10%水合氯醛(天津市光復精細化工研究所，批號：20190401)；牙科水泥(上海玉研科技有限公司，批號：191009)；牙科水泥自凝水(上海玉研科技有限公司，批號：190326)；注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠，批號：A190403015)；旋轉蒸發儀(上海圣科儀器設備有限公司，型號：RE 2000A)；電子分析天平(梅特勒賽多利斯科學儀器有限公司，型號：BS110S型)；冰箱(深圳市寶安區沙井廣氏電器廠，型號：BCD-629WDEYU1)；動物行為檢測系統(Clever Sys公司，美國，型號：HomeCageScan3.0)、睡眠生物解析系統(Biotex Kyoto公司，日本，型號：VitalRecorder3.0)、動物睡眠分析軟件(Kissei Comtec株式會社，日本，版本號：Sleepsign3.0)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SPF級雄性SD大鼠隨機分為4組，即空白對照組、模型組、固本健腦液組、褪黑素組，每組10只。大鼠適應性喂養7 d后開始建立AD模型，除空白對照組外。具體操作如下：取大鼠稱取體質量后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取腦立體定向儀固定大鼠，刮掉頭頂毛發后碘伏(河南華凱生物科技有限公司，批號：20210302)消毒，沿顱骨正中切開，分離皮下組織和筋膜，參照腦立體定位儀，以前囟“十”字縫中心點為零點，正中線向后4 mm，矢狀線左右各3 mm，標記位置，鉆孔后微量進樣器吸取2 μL Aβ1-42，注射后停留針頭2 min，慢慢取出針頭，對側行同樣操作。大鼠注射結束后，縫合頭皮，傷口處用碘伏消毒，棉簽涂抹馬應龍痔瘡膏(馬應龍藥業集團股份有限公司，批號：20210118)，每只肌內注射4萬U青霉素鈉預防感染。待大鼠蘇醒后放回籠中，記錄造模日期。空白對照組同上位置注射0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業股份有限公司，批號：L212062101)，其余操作相同。

1.2.2 給藥方法 固本健腦液組予以劑量為16 g/(kg·d)固本健腦液灌胃；褪黑素組予以給藥劑量0.09 mg/(kg·d)。共灌胃8周，空白對照組及模型組以等量0.9%氯化鈉溶液胃。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 Morris水迷宮行為學測定 用幾滴食用色素使池水變黑，然后將水深保持在31.5 cm，溫度保持在(23±1)℃，在水面以下設置1.5 cm圓形透明有機玻璃平臺，用虛線將池劃分為4個相等的象限，以進行描述性數據收集，將隱藏平臺放置在水迷宮的第三象限(Q3)，提捏大鼠尾部將其面向池壁分別從4個象限的固定位置進入水中，通過攝像機在連接到基于計算機的圖形分析軟件的水迷宮上捕捉大鼠的游泳行為，記錄大鼠尋找到第三象限平臺的逃潛伏期，并計算其平均隱藏潛伏期[7]。

1.2.3.2 大鼠晝夜節律檢測 采用HomecageScan 3.0實時監測系統檢測各組大鼠在籠內的所有周期性刻板樣行為并進行分析，觀察時間為24 h。操作前先按該軟件系統的說明對大鼠的居家籠光照及黑暗背景進行保存，對籠內前后上下左右及邊框的高度進行準確的設置與描繪，并對墊料的高度以及飲食飲水等活動區域皆進行設置，然后將各組大鼠隨機放置籠內允許自由活動。系統通過紅外線熱成像探測及視頻軌跡追蹤，通過攝像頭識別記錄20多種復雜的行為如：睡、睡醒、理毛、吃、喝、嚼、跳、扭動、嗅、撓、站、蹲、攀、走、跑、落地、轉圈、挖、掘、暫停、伸展身體、連續跳動、小便等的次數來進行時空序列分析，以此判定老年失眠大鼠模型復制成功，其中前12 h是日間模式，后12 h為夜間模式。

1.2.3.3 大鼠電極埋置術 手術埋置記錄電極前禁食24 h，10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠頭頸部毛發剃凈，將大鼠固定于腦立體定位儀，切開顱頂皮膚，露出顱骨前后囟并使用0.9%氯化鈉溶液沖洗。按照參考文獻[7]進行定位，分別在顱骨上前/后囟前2 mm，中線右側旁開2～3 mm處以0.8 mm鉆頭鉆孔，在鉆通顱骨又未觸及腦組織后停止，安裝腦電記錄電極螺絲，將螺絲固定好后用來記錄腦電圖(Electroencephalograhpy，EEG)；在囟門前2 mm，以中間線左側2～3 mm處鉆孔，不直接進入穿破顱骨，并安裝參考電極螺絲，將螺絲固定后，將用來記錄肌電圖(Electromyogram，EMG)的2根無菌導線直接插入頭后頸肌，用牙科水泥固定凝結后縫合傷口。術后將實驗大鼠單籠置于睡眠生物分析系統中，肌內注射青霉素鈉4萬U預防感染，連續注射3 d，大鼠恢復2周。在恢復期結束時，將大鼠頭部電極插座連接到腦電/肌電信號插頭，再連接到多通道萬向輪。通過記錄線將信號連接到放大器，對信號進行濾波(EEG,0.5～30 Hz；EMG,20～30 Hz)經放大后輸入計算機，經模數轉換成最終的數字信號。訓練結束后在實驗環境實行明暗(L/D:12 h/12 h)光照周期處理，隨后描記腦電和肌電，記錄時間為7：00至次日7：00，連續記錄24 h。

1.3 腦電肌電記錄及分析 固本健腦液治療后記錄大鼠EEG/EMG，大鼠的腦電及肌電信號由記錄導線接入放大器，由睡眠生物解析系統放大、濾波至電腦數模轉換后，用Sleepsign軟件進行獨立記錄和分析，記錄后，每10秒作為分析單元進行自動掃描，以統一標準區分覺醒(Wake)、快速眼球運動(Rapid Eye Movement，REM)和非快速眼動(Non-rapid Eye Movement，NREM)睡眠，一旦分析和掃描完成，就需要人工檢查，并在必要時進行適當的糾正。

圖1 睡眠時相的解析原理

2 結果

2.1 固本健腦液對大鼠學習記憶能力的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，目標象限游泳時間百分比顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，所有觀察組逃避潛伏期顯著縮短，目標象限游泳時間百分比顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及目標象限游泳時間百分比比較

2.2 HomeCage監測睡眠情況 與空白對照組比較，模型組睡眠覺醒次數多(P<0.05)，睡眠持續時間顯著性降低(P<0.05)且晝夜節律顛倒；與模型組比較，固本健腦液組睡眠覺醒次數減少(P<0.05)，睡眠持續時間較長(P<0.05)且睡眠晝夜節律正常；而褪黑素組則表現為雖有覺醒次數減少(P<0.05)，但睡眠總時長延長(P<0.05)，失去晝夜節律。見圖2～3。

圖2 各組大鼠生物節律行為次數

圖3 大鼠睡眠持續時間

2.3 Sleepsign腦電肌電描記結果 與空白組比較，模型組白天覺醒累積量明顯增高(P<0.05)，覺醒次數顯著增多(P<0.05)，REM睡眠累積量明顯降低(P<0.05)，夜間NREM睡眠顯著降低(P<0.05)；褪黑素組白天睡眠累積量無顯著差異，睡眠持續時間顯著升高(P<0.05)，REM睡眠累積量明顯降低(P<0.05)，夜間NREM睡眠累積量明顯增多(P<0.05)；固本健腦液組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4～5。

圖4 各組睡眠-覺醒時辰變化示意圖

圖5 各組大鼠NREM,REM和覺醒量的比較圖

3 討論

大量研究發現睡眠節律障礙與AD存在密切的相互作用[8-10]。有研究表明，通過對AD模型鼠進行慢性睡眠剝奪可加速AD鼠腦內的Aβ異常沉積，從而使得學習記憶障礙加重[11]。由此推測睡眠節律紊亂可能造成腦組織內Aβ異常沉積，促進AD的發病進程。AD患者腦組織內存在大量的炎癥反應，腦組織內炎癥反應能夠抑制神經元新生、加速神經元丟失，進一步加重腦組織損傷[12]，這種睡眠障礙與AD之間的關聯性也為研究AD的發病機制提供了新的思路。另外有研究表明，睡眠是調節學習記憶和情緒調節的重要腦部活動[13]，而睡眠障礙則會導致記憶功能減退、認知能力降低，從而增加AD患病的可能性[14]，并且大部分AD患者均存在不同程度的睡眠節律紊亂情況。固本健腦液是具有健腦安神功效的一種方劑，能補脾腎之虛，固人體精氣血之本，從而健腦安神，結合古今醫家對失眠發生病因病機的認識，認為老年失眠主要是脾腎等臟腑虛衰，氣血不足所致，所以其治療也當以補腎健脾，以養精氣血之本，使腦健神安為主，故用本方以達固本健腦之功。亦有早期研究提示湯劑能夠明顯改善AD模型鼠的睡眠障礙及學習記憶能力[15]，本研究在此基礎上進一步對其作用機制進行分析。

AD是一種不可逆轉的認知損害，也是最常見的癡呆癥類型。在進行性認知障礙的同時，晝夜節律紊亂也在AD的進展中起著關鍵作用[16]。這種晝夜節律的紊亂可發生在AD的早期階段，也可隨著疾病的發展，在AD晚期發生更加嚴重的睡眠-覺醒周期紊亂[17]。研究發現，AD小鼠存在不同程度的睡眠異常：8周齡Tg2576小鼠睡眠正常，但發現其24周齡時存在快速眼動睡眠時長減少的現象，且隨著月齡的增長加重[18-19]。APP/PS1小鼠也可表現出睡眠腦電圖以及睡眠-覺醒周期異常[20]。另一方面，睡眠障礙也可成為導致或加重AD的危險因素[21]，已有研究發現，對AD小鼠的慢性睡眠剝奪，不僅導致了Aβ沉積的加快，也可使突觸損傷導致學習記憶能力下降更為嚴重[22]。以上都是晝夜節律系統的紊亂和AD發病機制中具有的共同的特征及致病因素，這也揭示了將它們作為一條相互依賴的途徑進行研究的前景。

綜上所述，可以得知固本健腦液對于晝夜節律與AD的交互作用研究具有一定意義，有望為AD相關晝夜節律紊亂機制的深入研究提供新的治療思路。改善睡眠質量恢復晝夜節律對于AD患者來說可能不再僅僅是對癥治療，而極有可能成為針對AD病因進行防治的有效方法。