鵝星狀病毒的研究進展

李盈，郭旭

（海南保亭黎族苗族自治縣畜牧漁業服務中心，海南 保亭 572300）

鵝星狀病毒(goose astrovirus, GoAstVs)是一種以引起鵝內臟和關節中尿酸鹽沉積為特征的新型病毒。近年來，有關該病毒感染鵝的病例逐漸增多，在我國許多省份造成了鵝產業的巨大經濟損失。加強對鵝星狀病毒的研究對于防治小鵝痛風等疾病具有重要意義。本文主要從病原學、臨床特征、流行現狀、診斷檢測技術、防控技術等方面進行綜述，旨在為進一步研究星狀病毒提供參考依據。

1 鵝星狀病毒概述

1.1 星狀病毒特征

星狀病毒(astrovirus,AstVs)可感染人類、哺乳動物、禽類等多種動物。最早于1965年從仔鴨中被發現，1984年被正式命名為星狀病毒[1，2]。星狀病毒屬于星狀病毒科，是一種無包膜的單鏈陽性RNA病毒，表面有明顯的星狀突起[3]，病毒顆粒直徑為28~30 nm, 基因組長度因物種而異，范圍為6.4~7.9 kb，包括5’端非編碼區、3’端非編碼區和三個開放的閱讀框架（ORF1a, ORF1b,ORF2）。ORF1a和ORF1b編碼非結構蛋白，二者之間包含高度保守的基因序列。ORF2編碼病毒粒子形成所需的病毒衣殼蛋白[4]。病毒衣殼蛋白又包含一個保守的衣殼核和一個可高度變異的刺突結構域。該刺突結構域極有可能是宿主抗體的靶點。另外，ORF2的氨基酸序列被用作星狀病毒分類的基礎。ORF2中氨基酸序列的同源性大于75%的被歸為同一種星狀病毒[5]。

1.2 星狀病毒分類

星狀病毒可根據感染哺乳動物和禽類的能力，分為哺乳動物星狀病毒屬（Mamastrovirus, MAstV）和禽類星狀病毒屬（Avastrovirus, AAstV）[6]。哺乳動物星狀病毒主要感染人類、綿羊、豬、牛、老鼠、貓、犬等哺乳動物，禽類星狀病毒主要感染雞、鴨、火雞、鴿子、鵝等禽類。但是這種基于宿主類群的分類似乎并不準確，對星狀病毒遺傳和進化的研究表明它們有跨越物種屏障、適應新的宿主和物種的潛力[7]。星狀病毒的遺傳變異和跨物種傳播存在人畜共患感染的風險。

1.3 鵝星狀病毒特征

鵝星狀病毒(goose astrovirus, GoAstVs)于2005年在小鵝痛風病例中被發現[8]，2016年11月在山東被發現，這是首次在我國發現鵝星狀病毒，其基因組長度為7.2 kb[9]。ORF2編碼的衣殼蛋白（Cap蛋白）是鵝星狀病毒唯一的結構蛋白，在感染環節參與了病毒吸附及復制，且是GoAstV的主要抗原區域，能介導病毒入侵宿主細胞，是研究的重點[10]。

目前發現鵝星狀病毒有GoAstV-1和GoAstV-2兩種基因型，均可導致雛鵝痛風的臨床癥狀[11]。研究證明，GoAstV-2基因型對1~15日齡的雛鵝具有高致病性，但對25~35日齡的雛鵝僅造成輕微癥狀[12]。GoAstV-1和GoAstV-2兩種基因型可以共同存在于一個宿主體內，出現協同作用，發病頻率略高于GoAstV-1[13]。WANG A P等[14]實驗感染雛鵝，結果顯示GoAstV-1和GoAstV-2陽性率分別為36.36%和54.55%，兩種病毒合并感染率為21.21%。另外，GoAstV也可在家禽、水禽之間跨物種傳播[15，16]，也可以在鵝體內垂直傳播[17]。引起鵝痛風的GoAstV-2大約在2010年出現，而GoAstV-1出現得比GoAstV-2早，估計在1985年4月已出現，基于貝葉斯分析，GoAstV的平均進化速率約為每年每個位點發生1.42×103個核苷酸替換[18]。

2 臨床癥狀

鵝星狀病毒主要感染3周齡以下的雛鵝，該病可持續7~10 d，發病率和死亡率高，致死率為50%~80%。受感染的小鵝出現痛風、厭食、精神沉郁、拉白色糞便，嗜睡，部分小鵝眼瞼變灰色、混濁，生長也會受到抑制。解剖發現膽囊、腎臟、心臟、肝臟、氣管等器官和關節出現尿酸鹽沉積；腎臟的損傷最為嚴重，出現出血和腫脹[19]。組織病理學分析顯示腎小管上皮細胞壞死、脫落，炎癥細胞浸潤腎臟組織中，肝細胞空泡變性伴炎癥，脾淋巴細胞浸潤、解體、壞死，小膠質細胞增殖，在大腦皮層中，死亡的神經細胞被小膠質細胞包裹。痛風病的鵝盲腸絨毛明顯縮短，抑制了腸粘膜屏障的功能。此外，在死亡的雛鵝中觀察到腦炎病變。發病存活下來的鵝生長緩慢，容易受到細菌感染[20]。

3 發病機理

鵝星狀病毒在鵝身體的多個組織中復制，包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、法氏囊、胸腺、胰腺、腦、腺胃和腸。病毒在腎臟的出現率最高，其次是脾臟和肝臟[21]。蘇木精染色顯示，脾切片中脾細胞出血和壞死；腎切片間質出血，腎小管壞死和腎小球腫脹，尿酸結晶；肝切片的肝細胞變性。GoAstV感染早期可激活宿主免疫反應，TLR3、RIG-I和MDA5參與了GoAstV的宿主免疫應答，感染過程中IFN I型(IFN-α、IFN-β)、炎癥因子(IL-8、IL-10、TNF-α)、抗病毒蛋白(Mx、OASL、PKR)和MHC-I的表達也上調。相比之下，促炎細胞因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表達被抑制。然而，快速的病毒復制、抑制炎癥因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表達可能是宿主免疫反應不能提供足夠的保護來對抗GoAstV感染的原因[20]。研究指出，GoAstV感染可引起腎上皮細胞自噬，刷狀緣和細胞間連接破壞，足細胞損傷，纖維化增加，最終導致腎臟損傷[22]。Moser等人[23]研究表明，星狀病毒可以增加上皮細胞的通透性。星狀病毒誘導的腎上皮細胞通透性增加可能導致痛風病。此外，由于家禽缺乏精氨酸酶，氨不能代替嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤加工成尿素，然后氧化成尿酸，形成尿酸鈉和尿酸鈣，最后通過腎臟排泄。如果尿酸鹽形成的速率大于泌尿器官的排泄能力，則內臟表面上的尿酸鹽沉積物可引起痛風[24]。因此，引起腎臟和尿路損傷或尿液濃度和尿排泄紊亂的因素可以促進尿酸鹽沉積物的形成。鵝星狀病毒可引起腎臟損害，這可能是引起小鵝痛風的主要原因。

4 流行現狀

2016年11月，鵝星狀病毒在山東被發現，并迅速蔓延到我國的其他主要產鵝省份[25]，江蘇、河南、河北、安徽、湖北、廣東、湖南、遼寧、福建、浙江、四川、內蒙古、黑龍江、海南等省均有GoAstV感染檢測陽性的報告。不同的省份感染率和死亡率有一定差異。ZHU Q H等[26]在黑龍江省鵝場檢測出GoAstV-2型鵝星狀病毒。與GoAstV原株相比，菌株HLJ2021的刺突結構域540Q氨基酸位點發生了影響蛋白結構的突變。菌株HLJ2021與AstV/HB01/Goose/0123/19發生重組，產生重組菌株。HLJ2021菌株對小鵝也表現出較強的致病性。感染死亡率為83.3%。FU X L等[18]對廣東省和福建省的GoAstV基因組進行進化分析，結果表明GoAstV在中國南方鵝體內廣泛存在，且GoAstV-1和GoAstV-2在鵝體內循環。

5 診斷檢測技術

ORF2開放閱讀框的5’端基因序列屬于保守基因序列，該特征為研制Cap蛋白抗體和以Cap保守區域為基礎設計引物和探針奠定了理論基礎。

5.1 反轉錄環介導等溫擴增反應（RT-LAMP）檢測

在病毒學診斷技術的研究進展中，環介導等溫擴增（LAMP）技術可以在短時間內擴增核酸，已用于快速檢測各種病毒，包括禽星狀病毒[27]。LAMP檢測用一套4個特異性引物可以識別6個不同的序列，是一種成本低、省時、高特異性和靈敏性的方法[28]。根據ORF1b基因的保守區設計并篩選出兩組引物，最終確定采用一引物組在水浴鍋中完成RT-LAMP的檢測，反應的最佳溫度和時間分別為61 ℃和30 min，利用瓊脂糖凝膠電泳和染料指示劑顯色對RT-LAMP結果進行評估。RT-LAMP法檢測GoAstV分別基于瓊脂糖凝膠電泳結果和肉眼檢測顏色變化所判定的靈敏度，與熒光定量法靈敏度相同。RT-LAMP方法所用引物組可特異性地檢測GoAstV，并未與其它常見的禽類病原體發生交叉反應。

5.2 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測

RT-PCR方法也可以用來檢測鵝星狀病毒，基本原理是提取陽性GAstV病料的RNA并進行反轉錄，以反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增[29，30]。

RT-PCR擴增反轉錄體系為：2 uL引物、4 uL 5×反轉錄緩沖液，2 uL二硫酸糖醇（DTT）、7 uL RNA模板、4 uL dNTP Mix（10 mM）。42 ℃反應50 min，82 ℃反應5 min，得到cDNA。

以cDNA為模板進行PCR擴增的反應體系為：2 uL 引物、6 uL 雙氧水、2 uL cDNA、10 uL Mix酶，95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環，72 ℃延伸 10 min。之后將獲得的PCR產物加入1%凝膠中進行電泳并進行紫外分析[31，32]。根據GAstV-1和GAstV-2差異最大的ORF2的基因序列設計兩對引物，可以在FAM和VIC通道中分別獲得gstv -1和gstv-2的熒光信號，gstv -1和gstv -2的檢出限分別為33.3、33.7倍/μL 。RT-PCR方法具有較高的特異性、敏感性和重復性，可用于臨床對GAstV-1和GAstV-2的檢測[33]。

5.3 雙重定量PCR（qPCR）檢測

YANG K K等結合鵝細小病毒(GPV)和鵝星狀病毒(GAstV)的保守基因組區設計兩對引物，使用雙重定量PCR (qPCR)方法同時檢測這兩種病毒。根據GPV(變性溫度82.1 ℃)和GAstV(變性溫度79.8 ℃)不同來區分它們。與其它水禽病毒混合試驗沒有產生交叉反應。 GPV和GAstV的檢出限分別為5.74 × 101倍/μL和6.58 × 101倍/μL。研究表明該方法具有較高的靈敏度、特異性和重復性，可用于流行病學研究，能有效控制GPV和GAstV的傳播[34]。

5.4 定量環介導等溫反應擴增（qLAMP）檢測

定量環介導等溫反應擴增（qLAMP）方法檢測鵝星狀病毒簡便、靈敏、快捷。一組4個特異性引物，包括2個內引物和2個外引物，以鵝星狀病毒的ORF1a基因作為靶向基因進行PCR擴增，之后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。鵝星狀病毒qLAMP擴增的最優條件為：25 uL LAMP反應體系中加入2個內引物（各1 uL）、2個外引物（各1 uL）、2.5 uL 10×等溫擴增緩沖液，1 uL Bst DNA聚合酶（8 U/uL）、2 uL DNA模板、11.25 uL無核酸酶水、3.5 uL dNTP Mix（10 mM）、1.5 uL MgSO4(100 mM)，擴增溫度為65 ℃恒溫水浴，反應時間60 min。qLAMP檢測方法特異性強，穩定性好，與其它病毒無交叉反應，對鵝星狀病毒檢出最低限為1×101倍/uL，與傳統PCR的檢出最低限1×104倍/uL相比，靈敏度要高許多[35]。

5.5 免疫學診斷方法

使用抗體的免疫學診斷方法是篩選和分析病毒抗原的較好方法。單克隆抗體（mAb）被廣泛應用于免疫學診斷。鵝星狀病毒纖突蛋白（VP27蛋白）是一種重要的衣殼蛋白，是開發診斷試劑的候選蛋白，可以誘導宿主產生中和抗體。

5.5.1 Cap蛋白單克隆抗體的制備[36，37]通過克隆VP27基因來制備特異性單克隆抗體（mAb），經蛋白質印記分析和免疫熒光分析表明，該單克隆抗體可特異性識別感染細胞中的VP27，具有較高的診斷潛力。

制備抗原：以Cap保守區域為基礎設計引物，并以cDNA為模板進行基因擴增，回收目的基因片段，并將該目的基因與大腸桿菌表達載體（pET-30a）進行酶切反應以獲得陽性重組表達質粒pET-30a-Cap，并將其接種到LB培養基中培養，并加入1 mmol/L的誘導劑ITPG（異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）誘導5 h，采用尿素法進行變性復性，并利用鎳柱系統進行蛋白純化。采用Western blot方法對獲得的重組蛋白進行純度鑒定，在目的位點出現特異性條帶則可作為免疫原免疫實驗動物制備單克隆抗體。

動物免疫與細胞融合：將純化、鑒定后的重組蛋白乳化后，皮下注射實驗動物（一般為BLAB/C實驗小鼠），經過三次免疫，取免疫后的小鼠脾臟制備細胞懸液，與對數期生長的骨髓瘤細胞進行細胞融合。

雜交瘤的篩選及抗體性質檢測：通過HAT選擇培養基（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷）或者ELISA的方法篩選出呈陽性的雜交瘤細胞。之后檢測陽性雜交瘤細胞的抗體性質，包括特異性、中和活性、親和力、亞類、識別抗原表位等的檢測與鑒定。

雜交瘤的克隆化：選取抗體性質優良的雜交瘤細胞，采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法進行克隆純化，制備腹水。

5.5.2 Cap蛋白多克隆抗體的制備 呂炫等[38]通過大腸桿菌系統表達純化GAstV-2 Cap蛋白，制備了具有較高效價的多克隆抗體。劉莉等[39]采用同樣的方法制備了GAstV-1Cap蛋白的多克隆抗體。

與多克隆抗體相比，單克隆抗體性質更穩定，對抗原的特異性更強。蛋白抗體的制備技術可為鵝星狀病毒感染的臨床診斷及檢測方法的建立奠定理論基礎。

6 防控技術

6.1 鵝星狀病毒感染的預防

6.1.1 注射有效疫苗和抗體 疫苗接種是預防病毒的重要措施。Sellers 等[40]研究表明通過用桿狀病毒表達系統表達的雞星狀病毒衣殼蛋白接種種雞，能夠刺激機體產生抗體，而且可以通過卵黃將抗體傳遞至后代維雞。目前，還沒有商業化的疫苗或其它方法來預防鵝星狀病毒。孫永林[31]用制備的卵黃抗體對1日齡雛鵝進行頸部皮下注射免疫（免疫劑量為1 mL），免疫過的雛鵝精神狀態良好，未出現尿酸鹽沉積、痛風等臨床癥狀，這表明卵黃抗體對鵝星狀病毒有較好的預防效果。D. Xu等[41]通過在重組的GAstV蛋白中插入鵝源新城疫（NDV）弱毒株制備二價疫苗，對GAstV和NDV感染均具有一定保護作用，但由于各種GAstV亞型之間混合感染，使用其它病毒作為疫苗載體需要進一步研究。榮雪路等[42]制備了鵝星狀病毒重組衣殼蛋白亞單位疫苗，并在開產前5周對種鵝進行胸部肌肉注射（1 mL/羽），28 d后對種鵝進行免疫效力測定，抗體效價不低于3.6 log2，產蛋卵黃中抗體效價不低于3.01 log2，孵出的雛鵝血清中抗體效價不低于2.7 log2，免疫效果良好。姚倫廣等[43]研制了鵝星狀病毒滅活疫苗，并進行攻毒試驗，可實現100%保護。張立武[44]等研究發現，卵黃抗體雖可預防鵝星狀病毒，但預防保護期短，需要重復注射來控制嚴重疫情。滅活疫苗的缺點是至少有7 d的免疫空白期，而鵝易在免疫空白期內感染而發病。針對卵黃抗體和滅活疫苗的不足，用SD毒株作為滅活抗原，經過兩次乳化制備的一種卵黃抗體復合物，一方面可以有效預防鵝星狀病毒，另一方面預防保護期較長，可以對鵝的整個生長周期進行保護。王桂軍等[45]采用薄膜擴散法制備脂質體作為疫苗佐劑把VP27蛋白包裹起來，起到緩釋抗原的作用，可以延長抗原蛋白在機體內的時間，使受免疫動物可持續產生中和抗體，從而進一步延長免疫保護期。

6.1.2 切斷傳播途徑 環境控制：合理選擇鵝場地址，場地布局和設施設備要科學，從無疫區的標準化種禽場引種，并做好引種檢疫，有效切斷傳播途徑。加強飼養管理：合理安排飼養密度，配置營養合理的飼料，減少應激；實行全進全出飼養，空場或空舍2周以上方可飼養下一批雛鵝。嚴格執行消毒程序：做好空舍消毒、帶鵝消毒、用具消毒、人員車輛消毒等；鵝群清空后，對非易燃的籠具、地面進行火焰消毒；另外，在中午選用0.2%~0.3%的過氧乙酸帶鵝噴霧消毒[46，47]。做好無害化處理：對病死鵝、墊料、糞便等進行無害化處理，防止疫病傳播。

6.2 鵝星狀病毒感染的治療

飲水中添加護腎利尿的藥物和葡萄糖可促進尿酸排出，緩解痛風癥狀。孫永林[32]對雛鵝開展攻毒治療試驗，研究表明分別在1日齡和7日齡注射兩次卵黃抗體，可有效治療雛鵝痛風。張凌云等[48]用鵝星狀病毒亞單位疫苗免疫之后制備的卵黃抗體連續10 d注射患病鵝，死亡率可降至5.4%~6.4%，研究表明卵黃抗體可有效治療鵝星狀病毒感染。李海利等[49]研發一種中藥制劑（黃芪40份、石韋20份、梔子16份、金銀花12份、蟑螂10份、黃芩6份、茵陳蒿6份、苦參3份、萹蓄2份），肌肉注射患病鵝（4 mL只，2次/d），可顯著降低尿酸鹽濃度，有效控制病情。

7 結論與展望

鵝星狀病毒是危害我國鵝產業發展的一種新型病毒，疫苗的研制與應用仍然是鵝星狀病毒研究的重點。制備具有較好防控效果的疫苗需要不斷模仿病毒感染的過程，不斷了解鵝星狀病毒傳播的特點和感染機制才可以從根本上解決鵝星狀病毒感染所導致的鵝痛風問題。未來的研究可以從鵝星狀病毒跨宿主傳播的致病性、鵝星狀病毒的致病機制、鵝星狀病毒治療藥物的研發等方面開展。